田 武，張 研

(北京大學 生命科學學院 膜生物學國家重點實驗室；北京大學 麥戈文腦科研究所， 北京 100871)

1 神經(jīng)發(fā)育性細胞凋亡

細胞凋亡，也稱為程序性細胞死亡，是一種受到非常特定的細胞內(nèi)信號通路嚴格控制的有組織的細胞死亡。凋亡的細胞很容易通過典型的形態(tài)特征所辨認出來，如: 染色質(zhì)凝集、細胞皺縮、細胞質(zhì)膜出泡，最終形成凋亡小體及其很快被周圍細胞所吞噬。

細胞凋亡發(fā)生在所有物種的所有組織的生命周期中，是細胞增殖自我平衡的一部分。細胞凋亡可以消除異常的、衰老的、非功能的、錯誤的或潛在的有害細胞。在發(fā)育過程中，細胞凋亡可以使細胞在有限的發(fā)育階段完成短暫的功能，同時也可以消除曾經(jīng)發(fā)揮作用但在進化過程中將被淘汰的身體部分，比如在發(fā)育中的脊椎動物四肢中，趾間細胞消失，從而產(chǎn)生自由的足趾。細胞凋亡在胚胎期和出生后的早期階段也廣泛地影響著神經(jīng)系統(tǒng)。小鼠的大腦新皮質(zhì)中，在胚胎(E)14日爆發(fā)的第一次細胞凋亡高潮主要影響神經(jīng)元前體細胞，第二次細胞凋亡高潮發(fā)生在出生后發(fā)育階段的早期，主要影響早期的有絲分裂后神經(jīng)元。

通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(TUNEL)或原位末端標記法(ISEL)來標記碎片化的核DNA，我們確定在出生后第一周，大鼠大腦皮質(zhì)中凋亡神經(jīng)元的數(shù)量為4～12個/mm2，小鼠中則是7個/mm2，而在成年階段檢測不到正在凋亡的神經(jīng)元。DNA鏈斷裂表明神經(jīng)元已經(jīng)處在細胞凋亡過程的后期階段，標記激活的凋亡蛋白酶- 3則使我們可以檢測到剛開始開始細胞死亡程序的細胞。凋亡后細胞在2.5 h內(nèi)會被吞噬細胞清除。從P5到P20，中間神經(jīng)元的數(shù)量減少了40%[1]，而從P1到P5，海馬體失去了大約一半的神經(jīng)元。鑒于促凋亡或抗凋亡因子的整體敲除會導致神經(jīng)和非神經(jīng)組織的異常生理性細胞死亡，并進一步導致胚胎早期致死，我們通常使用條件性敲除來了解早期神經(jīng)元細胞凋亡的作用。過表達抗凋亡因子Bcl- 2則能抑制神經(jīng)元細胞凋亡，導致神經(jīng)系統(tǒng)過度增生。相反，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)元中，條件性敲除抗凋亡因子Bcl-xl會導致小腦癥和神經(jīng)行為障礙，如過度活躍、學習和記憶缺陷[2]。因此，細胞凋亡可以維持神經(jīng)元數(shù)量，并最終確保神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)育正常。

細胞凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)的形成中發(fā)揮重要作用，因此細胞凋亡受到各種因素的嚴格調(diào)控。在外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中，發(fā)育中的神經(jīng)細胞會競爭它們的靶組織釋放的有限量的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白——神經(jīng)生長因子(NGF)。移除靶組織會增加支配性神經(jīng)元凋亡的比例[3]，而增加靶細胞數(shù)量則會減少死亡的神經(jīng)元數(shù)量。因此，細胞凋亡的作用是使神經(jīng)元的數(shù)量與預(yù)期靶組織的大小相匹配。雖然敲除單個神經(jīng)營養(yǎng)因子或其相應(yīng)的受體都會導致PNS中神經(jīng)元的大量消失，但它并不能在CNS中引起顯著的促細胞凋亡反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一種假說，認為兩個不同的過程分別控制了PNS和CNS的細胞凋亡。事實上，發(fā)育中的CNS神經(jīng)元似乎更多地依賴于電活動和突觸輸入，而不是生長因子[4]。細胞死亡區(qū)別地作用于不同的神經(jīng)元亞細胞群，這表明它不僅能確保新皮質(zhì)神經(jīng)元的最終數(shù)量，還能進一步調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)的細胞構(gòu)成。因此，細胞凋亡是發(fā)育過程的重要組成部分，它塑造了神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。

2 細胞凋亡調(diào)節(jié)的途徑及機制

細胞凋亡可以由所謂的外部途徑來啟動：胞外蛋白激活細胞表面受體來招募起始性凋亡蛋白酶，形成死亡誘導信號復(fù)合物(DISC)。DISC激活凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)并導致細胞的瓦解。在細胞內(nèi)信號中，發(fā)育中的神經(jīng)元也可以選擇性地通過胞內(nèi)信號啟動細胞凋亡，這被稱為固有途徑或線粒體途徑。在凋亡刺激后，細胞色素c從線粒體的膜間隙釋放到細胞質(zhì)中，并與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)和dATP形成凋亡體。這個復(fù)合物促進凋亡蛋白酶原- 9剪切并活化成為凋亡蛋白酶- 9。激活的凋亡蛋白酶- 9反過來將凋亡蛋白酶原- 3剪切為活化凋蛋白酶- 3(aCasp3)。這一激活作用標志著細胞凋亡已不可逆，而且aCasp3常被用作細胞凋亡的特定標記。凋亡蛋白依賴型的剪切要么激活靶蛋白(如DNA酶、蛋白酶、轉(zhuǎn)錄因子p53)，要么抑制靶蛋白(如核蛋白)，并最終導致不可逆轉(zhuǎn)的細胞瓦解。aCasp3還能進一步剪切其他凋亡蛋白酶，從而導致凋亡蛋白酶級聯(lián)的放大。

在細胞色素c水平上，細胞凋亡是由Bcl- 2家族成員調(diào)節(jié)。這個家族的蛋白質(zhì)由兩個對立的亞家族組成?？沟蛲龅膩喖易錌cl- 2/Bcl-xl通過維持線粒體的完整性來阻止細胞色素c進入細胞質(zhì)。相反，促凋亡的Bax/Bad 和Bid/Bim亞族的成員可以增加線粒體膜的滲透性，也可以與Bcl- 2/Bcl-xl亞族的成員結(jié)合，抑制它們的抗凋亡能力。因此，細胞凋亡可以通過調(diào)節(jié)抗凋亡和促凋亡因子之間的比例來進行自我調(diào)節(jié)。

許多外部的促生存刺激可以在細胞存活中起決定性作用。在這些刺激中，生長因子和胞內(nèi)Ca2+水平升高被認為在神經(jīng)發(fā)育性細胞凋亡中扮演著重要的角色。這些刺激觸發(fā)了三種主要的促生存信號傳導途徑：PI3K(磷酸肌醇3-激酶)/Akt通路、PKC(蛋白激酶C)/ERK(胞外信號調(diào)節(jié)激酶)通路和Ca2+/鈣調(diào)蛋白通路。簡單來說，在促生存信號的作用下，蛋白激酶PI3K激活了絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt。在細胞質(zhì)中，Akt可以直接磷酸化并失活Bcl- 2家族的促細胞凋亡成員、凋亡蛋白酶或Forkhead轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制細胞死亡。Akt可以進一步轉(zhuǎn)移到細胞核中，并將p53磷酸化，從而抑制細胞死亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和CREB(cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白)，以增加促生存基因的轉(zhuǎn)錄。Ca2+瞬變激活了絲氨酸/蘇氨酸激酶PKC通路或Ca2+/鈣調(diào)蛋白通路，從而刺激促生存相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。越來越多的證據(jù)表明Ca2+直接將信號從突觸傳遞到細胞核。通過這種Ca2+或生長因子依賴性的細胞凋亡抑制作用，在發(fā)育中的大腦皮質(zhì)中觀察到的典型自發(fā)性活動模式可能為神經(jīng)元提供了主要的促生存信號。

3 發(fā)育性細胞凋亡由不間斷活動調(diào)節(jié)

許多研究證明電活動可以直接影響神經(jīng)元的生存[5]。在體外培養(yǎng)了7天左右的嚙齒動物皮質(zhì)中，使用TTX沉默神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會顯著增加凋亡神經(jīng)元的數(shù)量。這一發(fā)現(xiàn)可以在體內(nèi)實驗中重復(fù)，在P2大鼠腦中注射TTX也能增加皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的數(shù)量。相反，通過提高胞外K+濃度來增強自發(fā)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)沖動，則會減少凋亡神經(jīng)元數(shù)量，這在取自E17～E18大鼠的皮質(zhì)和取自P0～P1小鼠的皮質(zhì)中均有發(fā)現(xiàn)。使用AMPA/kainate、NMDA或GABAA受體的拮抗劑會在體外實驗中減弱或抑制發(fā)育中新皮質(zhì)神經(jīng)元活性，并在體外及體內(nèi)實驗中提高凋亡神經(jīng)元的比例。在培養(yǎng)的新生鼠海馬神經(jīng)元中，同步監(jiān)測電活動和細胞凋亡的結(jié)果顯示，不活躍的神經(jīng)元死亡的可能性比集成到同步興奮網(wǎng)絡(luò)的神經(jīng)元要高10倍，因此這也證明，集成到一個同步網(wǎng)絡(luò)對未成熟神經(jīng)元是至關(guān)重要的。與此發(fā)現(xiàn)相一致的是，在神經(jīng)元聚集并形成最初的突觸后，使用Munc18- 1來破壞突觸前神經(jīng)遞質(zhì)會導致強烈的細胞凋亡反應(yīng)。有趣的是，通過敲除SNAP- 25基因來阻止誘發(fā)性遞質(zhì)釋放并不會導致E19小鼠大腦中大范圍的細胞凋亡反應(yīng)，這表明自發(fā)遞質(zhì)釋放可能直到出生前都為神經(jīng)元提供了足夠的促生存信號。由于純合子小鼠在出生后無法存活，因此在出生早期階段無法對細胞凋亡進行研究[6]。條件性敲除SNAP- 25的小鼠可能是一個有意義的模型，它可以幫助我們更好地理解動作電位刺激與自發(fā)的突觸活動對于神經(jīng)元存活調(diào)節(jié)的意義。

總的來說，實驗數(shù)據(jù)表明，突觸驅(qū)動的同步興奮模式和自然發(fā)生的細胞死亡不僅在時間上有重疊[7]，而且在很大程度上可以影響細胞凋亡通路。然而，我們還需要更詳細的研究來確證這一觀點。不成熟活動模式的空間輪廓和細胞凋亡的區(qū)域分布在不同區(qū)域和不同層的發(fā)育中大腦皮質(zhì)之間是不均勻的。因此，在這兩個過程之間建立一個因果聯(lián)系將有助于理解每種早期活動模式在發(fā)育中功能性環(huán)路的細化過程中所發(fā)揮的作用。

4 與臨床的關(guān)聯(lián)

一系列的體內(nèi)實驗結(jié)果表明，抑制神經(jīng)傳遞依賴性自發(fā)活動會在神經(jīng)元發(fā)育的早期階段導致神經(jīng)元的喪失，這為神經(jīng)元活動水平和細胞凋亡率提供直接的聯(lián)系。乙醇通過阻斷NMDA受體和增強GABAA受體來抑制神經(jīng)活動。在P4- 7大鼠中，乙醇會在新皮質(zhì)中引發(fā)強烈的細胞凋亡反應(yīng)[8- 9]。嚙齒動物的出生后早期階段與人類的胚胎晚期階段相似，與動物實驗中的觀察結(jié)果一致，懷孕母親對乙醇的吸收會導致所謂的胎兒乙醇譜系障礙。這種綜合征表現(xiàn)包括大腦畸形，比如腦容量減少[10]。

絕大多數(shù)的麻醉藥是作為NMDA拮抗劑、GABA類似物或間隙連接阻斷劑來抑制神經(jīng)活動的。暴露于常見的混合麻醉劑后，嚙齒動物的P7新皮質(zhì)中會發(fā)生廣泛的神經(jīng)退行性病變，這也表明了細胞凋亡率的增加。與之類似，一些與GABAA和谷氨酸受體相互作用的抗驚厥劑會加重P8大鼠腦中的細胞凋亡反應(yīng)。在人類中，胎兒如果與這些藥物接觸，會引發(fā)永久性的結(jié)構(gòu)、行為和認知缺陷，包括大腦質(zhì)量減少、學習和記憶障礙、焦慮、社會交往和感覺運動障礙[10- 11]?？傊?，這些觀察強有力地證明，在體內(nèi)神經(jīng)元發(fā)育過程中，其活動水平的降低會使細胞存活與細胞死亡之間的平衡發(fā)生變化[12]，從而導致神經(jīng)系統(tǒng)永久的改變，而且某些細胞凋亡水平增高的特定發(fā)育階段 (嚙齒動物的出生后4～8 d，人類的胎兒發(fā)育晚期階段)對這種改變特別敏感。由此，我們很容易推測，病理性增強活動水平很有可能會減少凋亡神經(jīng)元數(shù)量[13]，最終會增加神經(jīng)元的數(shù)量，而且還會導致永久性大腦結(jié)構(gòu)損傷和神經(jīng)行為障礙。已經(jīng)證明過度增殖的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元會導致小鼠類自閉癥失常[14]，而自閉癥患者的大腦經(jīng)常會有過多的神經(jīng)元[15]。因此，我們需要進一步的實驗來闡明，在活動依賴性的細胞凋亡的關(guān)鍵階段，何種程度的不利條件和藥物會影響神經(jīng)細胞的生存，從而產(chǎn)生永久性神經(jīng)行為缺陷的病因。

5 結(jié)論

大量的研究已經(jīng)證明了神經(jīng)元活動對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要影響，例如影響神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)遷移[16- 18]。在大腦成熟過程中，細胞凋亡的嚴格調(diào)控是另一個重要的過程，神經(jīng)元活動可以通過此過程細化不同功能的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。細胞凋亡主要發(fā)生在出生后早期的發(fā)育階段，此時自發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)依賴型活動在新皮質(zhì)活動中占據(jù)主導地位。電活動通過特定的途徑來調(diào)節(jié)凋亡過程(Ca2+瞬變、神經(jīng)營養(yǎng)因子供養(yǎng))，并且依賴于電活動的同步性，以及神經(jīng)營養(yǎng)因子受體表達和細胞內(nèi)信號。為了充分理解電活動對神經(jīng)元細胞凋亡的作用，仍有以下幾個問題亟待解決。同步化活動提供足夠的生存效應(yīng)所依賴的準確的暫時性需求是什么?不同的電活動模式是否以其區(qū)域特異性為功能獨特的不同神經(jīng)回路的發(fā)育提供信號?活性依賴性凋亡是否會按不同的細胞類型來影響不同的皮質(zhì)神經(jīng)元亞型，從而幫助維持生理上興奮與抑制的平衡?更深入地了解早期活動模式在細胞凋亡過程中如何發(fā)揮作用，將有助于我們更好地理解長期性神經(jīng)缺陷的病因。

參考文獻：

[1] Southwell G, Paredes F, Galvao P,etal. Intrinsically determined cell death of developing cortical interneurons [J]. Nature, 2012, 491: 109- 172.

[2] Nakamura A, Swahari V, Plestant C,etal. Bcl-xl is essential for the survival and function of differentiated neurons in the cortex that control complex behaviors [J]. J Neurosci, 2016, 36: 5448- 5461.

[3] Hoerder-Suabedissen A, Molnar Z. Molecular diversity of early-born subplate neurons [J]. Cereb Cortex, 2013, 23: 1473- 1483.

[4] Dekkers J, Nikoletopoulou V, Barde Y. Death of developing neurons: new insights and implications for connectivity [J]. J Cell Biol, 2013, 203: 385- 393.

[5] Yang JW, Reyes-Puerta V, Kilb W,etal. Spindle bursts in neonatal rat cerebral cortex [J]. Neural Plasticity, 2016, 11:136- 142.

[6] Kirmse K, Kummer M, Kovalchuk Y,etal. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortexinvivo[J]. Nat Commun, 2015, 6:72- 90.

[7] Blanquie O, Liebmann L, Hubner A,etal. NKCC1-mediated gabaergic signaling promotes postnatal cell death in neocortical Cajal-Retzius cells [J]. Cereb Cortex, 2017, 27: 1644- 1659.

[8] Ikonomidou C, Bittigau P, Ishimaru J,etal. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome [J]. Science, 2000, 287: 1056- 1060.

[9] Lebedeva J, Zakharov A, Ogievetsky E,etal. Inhibition of cortical activity and apoptosis caused by ethanol in neonatal ratsinvivo[J]. Cereb Cortex, 2017, 27: 1068- 1082.

[10] Creeley E, Olney W. Drug-induced apoptosis: mechanism by which alcohol and many other drugs can disrupt brain development [J]. Brain Sciences, 2013, 3: 1153- 1181.

[11] Turski A, Ikonomidou C. Neuropathological sequelae of developmental exposure to antiepileptic and anesthetic drugs [J]. Front Neurol, 2012, 3: 120- 120.

[12] Lau D, Bengtson P, Buchthal B,etal. BDNF reduces toxic extrasynaptic NMDA receptor signaling via synaptic NMDA receptors and nuclear-calcium-induced transcription of inhba/activin A [J]. Cell Reports, 2015, 12: 1353- 1366.

[13] Vicario A, Kisiswa L, Tann Y,etal. Neuron-type-specific signaling by the p75(NTR) death receptor is regulated by differential proteolytic cleavage [J]. J Cell Sci, 2015, 128: 1507- 1517.

[14] Fang WQ, Chen WW, Jiang LW,etal. Overproduction of upper-layer neurons in the neocortex leads to autism-like features in mice [J]. Cell Reports, 2014, 9: 1635- 1643.

[15] Courchesne E, Mouton R, Calhoun E.,etal. Neuron number and size in prefrontal cortex of children with autism [J]. JAMA, 2011, 306: 2001- 2010.

[16] Nagode A, Meng XY, Winkowski E,etal. Abnormal development of the earliest cortical circuits in a mouse model of autism spectrum disorder [J]. Cell Reports, 2017, 18: 1100- 1108.

[17] Luhmann J, Khazipov R. Neuronal activity patterns in the developing barrel cortex [J]. Neuroscience, 2018, 1:256- 267.

[18] Luhmann J, Sinning A, Yang JW,etal. Spontaneous neuronal activity in developing neocortical networks: from single cells to large-scale interactions [J]. Front Neural Circuits, 2016, 10:45- 59.

新聞點擊

年長乳腺癌患者的“心”危機

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2016- 10- 16報道，最近一份研究指出，年長的早期乳腺癌女性患者的心血管疾病病死率高于乳腺癌病死率。

此份研究的目的是希望能了解現(xiàn)代社會的早期乳腺癌女性患者死于心血管疾病的發(fā)生率。研究團隊以1998—2012年間被診斷罹患早期乳腺癌的近10萬例女性為研究對象；利用行政機關(guān)及安大略省癌癥登記處(Ontario Cancer Registry)的數(shù)據(jù)庫獲得研究對象在過去的健康狀況，并以生命統(tǒng)計了解其死因，最后分析其健康狀況與心血管疾病病死率的關(guān)系。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，66歲以下沒有心血管疾病、糖尿病及高血壓的乳腺癌患者，死于心血管疾病的人較少，但是66歲以上的患者在確診罹患乳腺癌后的10年內(nèi)死于乳腺癌或心血管疾病的概率分別為11.9%及7.6%。而關(guān)于在罹患早期乳腺癌前有心血管疾病的患者5年內(nèi)死于乳腺癌及心血管疾病的概率一樣，5年后心血管疾病死亡率便大于乳腺癌病死率(心血管疾病病死率16.9%、乳腺癌病死率14.6%)。此外，66歲以上的早期乳腺癌女性患者自被診斷后存活了5年以上者，在被診斷后第10年心血管疾病病死率超過乳腺癌病死率，成為其主要的死因。

據(jù)此研究結(jié)論，心血管疾病對年長有早期乳腺癌的女性來說是需要被積極重視的健康風險，這份研究提醒了人們應(yīng)重視乳腺癌患者預(yù)防心血管疾病。

該研究刊登于美國醫(yī)學協(xié)會《JAMA內(nèi)科醫(yī)學雜志》。

2型糖尿病患者飯后宜散步

據(jù)美國WebMD醫(yī)學新聞網(wǎng)(2016- 10- 27)報道，最新研究顯示，有2型糖尿病的人在飯后簡短地散步可能比在其他時間運動更有助于降低血糖。

飯后血糖與心臟病風險有關(guān)，研究參與者在飯后散步比在其他時間運動的人血糖值平均降低12%。研究發(fā)現(xiàn)，飯后血糖降低最多的是在晚餐后散步，可減少22%。

新西蘭Otago大學的研究人員Andrew Reynolds認為，2型糖尿病患者每周至少要達到150 min的運動量。

但他強調(diào)，餐后運動的好處顯示目前的指導綱要需做修正，尤其是餐后的活動，特別是因為現(xiàn)在的餐食含有大量的碳水化合物。

專家認為，有許多試驗都是用運動來控制血糖，但運動與好的生活習慣通常還是不夠的，2型糖尿病患者應(yīng)結(jié)合良好生活習慣與適合的藥物，才能成功控制血糖。

該研究結(jié)果刊登在2016- 10- 17《糖尿病學》(Diabetologia)。