蔡志宏，曹怡靜，劉 姣，胡皓彬，謝 鑫，許雄峰，凌 暉*

(南華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.腫瘤研究所；2.2016級(jí)卓越醫(yī)師班，湖南 衡陽(yáng) 421001)

胃癌不僅在中國(guó)人群中的發(fā)病率很高，也是全球最常見(jiàn)的癌致死原因[1]。胃癌治療新手段的研究，已成胃癌防治領(lǐng)域新興的研究焦點(diǎn)。胃動(dòng)蛋白- 2(gastrokine- 2,GKN2)屬于分泌蛋白家族，其在正常胃黏膜組織中高表達(dá)，而在胃癌中表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)，提示GKN2可能作為候選腫瘤抑制基因在胃癌發(fā)生中起作用[2- 3]。研究發(fā)現(xiàn)GKN2特異性表達(dá)于胃黏膜組織[4]，GKN2表達(dá)缺失與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，并提示將來(lái)臨床上有望通過(guò)恢復(fù)GKN2表達(dá)的治療策略來(lái)抑制胃癌發(fā)生發(fā)展[5]。

本研究首先觀測(cè)GKN2在胃癌中的表達(dá)轉(zhuǎn)變，接著經(jīng)轉(zhuǎn)染GKN2使其高表達(dá)，驗(yàn)證其對(duì)人胃癌MKN28細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，為GKN2在胃癌變過(guò)程中作用的深入探尋提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例標(biāo)本及MKN28細(xì)胞系：標(biāo)本來(lái)自南華大學(xué)附屬一醫(yī)院，其中胃癌90例、癌旁組織48例、胃癌遠(yuǎn)端胃黏膜(從距腫瘤邊緣>5 cm處取得)組織22例。90例胃癌標(biāo)本中，高分化腺癌20例、中分化腺癌29例、低分化腺癌21例、黏液腺癌11例、印戒細(xì)胞癌9例。該實(shí)驗(yàn)已獲南華大學(xué)倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)書(shū)及受試者簽署的知情同意書(shū)。人胃癌MKN28細(xì)胞系來(lái)自本研究所保存。

1.1.2 試劑：免疫組化Ultrasensitive TM SP 試劑盒、DAB染色試劑盒(邁新生物技術(shù)有限公司)；Xhol_GKN3SP-hGKN2-TEV-SBP_Xhol表達(dá)載體和pCAGGS-Neo vector空載體由本所構(gòu)建；兔抗人GKN2單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體、兔二抗等(Abcam公司)；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)GKN2表達(dá)：采取LSAB法(又稱(chēng)鏈酶親和素過(guò)氧化物酶法)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，PBS(替代一抗)為陰性對(duì)照，依據(jù)Ultrasensitive TM SP 試劑盒說(shuō)明書(shū)實(shí)施步驟。蘇木精染色1 min, 自來(lái)水沖洗10 min，鹽酸分化10 s，自來(lái)水返藍(lán)5 min。脫水并中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察：陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)中顯示黃色或棕黃色者。結(jié)果判定：每一個(gè)高倍鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5為陰性，≥5為陽(yáng)性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞：用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基(青霉素、鏈霉素各100 U/mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞增殖至80%左右匯合時(shí)傳代。使用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，G418篩選，獲得穩(wěn)定高表達(dá)GKN2的MKN28細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)分為GKN2轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和空載體組。

1.2.3 Western blot驗(yàn)證GKN2蛋白的表達(dá)：提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，以30 μg總蛋白/孔的量在10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗(GKN2，1∶1 000；β-actin，1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后，加二抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光劑顯影，拍照，AlphaImager 2200軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞，由胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液(1×104cells/mL)，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔注入200 μL細(xì)胞懸液(含2 000個(gè)細(xì)胞)，設(shè)立空載體組、未轉(zhuǎn)染組和調(diào)零組，貼壁后在孔中培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔添加10 μL MTT液(5 g/L)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再溫育4 h即停止培養(yǎng)，然后每孔添加100 μL DMSO以便溶解，經(jīng)由10 min左右振蕩，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定A值(每孔取5個(gè)復(fù)孔)。

1.2.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：首先用胰蛋白酶消化各組MKN28細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液；Transwel小室分為上下兩室，在下室之中加入500 μL含血清的培養(yǎng)基(血清和培養(yǎng)基的加入比例為1∶9)，在上室中加入細(xì)胞懸液200 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，照相并計(jì)數(shù)。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲：將液態(tài)的BD基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基(依照1∶5的比例)混勻，吸400 μL注入Transwell上室，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中2 h，導(dǎo)致薄層凝膠產(chǎn)生。其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GKN2蛋白在胃組織中的表達(dá)

GKN2蛋白在癌旁組織中表達(dá)明顯弱于胃癌遠(yuǎn)端胃黏膜(P<0.05)。GKN2蛋白在胃癌組織中表達(dá)均顯著低于胃癌遠(yuǎn)端胃黏膜(P<0.01)和癌旁組織(P<0.01)(表1)。

表1 GKN2蛋白在胃癌遠(yuǎn)端胃黏膜、癌旁和胃癌組織中的表達(dá)

DGM.distal gastric mucosa; AT.the adjacent tissues; GC.gastric cancinoma;*P<0.05 compared with DGM;#P<0.05 compared with AT.

2.2 Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染前后GKN2蛋白表達(dá)的變化

與未轉(zhuǎn)染組和空載體組相比，轉(zhuǎn)染GKN2的MKN28細(xì)胞中GKN2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)(圖1)。

2.3 過(guò)表達(dá)GKN2對(duì)人胃癌MKN28細(xì)胞增殖的影響

與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和空載體組的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染GKN2的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞存活率(A值)開(kāi)始減低，48 和72 h后更顯著，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)關(guān)系(P<0.05)(表2)。

A.untransfected cells group； B.empty vector group；C.GKN2-transfected group; *P<0.05 compared with untransfected cells group and empty vector group圖1 GKN2轉(zhuǎn)染前后MKN28細(xì)胞中GKN2蛋白表達(dá)情況Fig 1 Expression of GKN2 protein in MKN28 cells with or without n=3)

24 hours48 hours72 hoursuntransfected cells0.24 ±0.030.44 ±0.020.63±0.03 empty vector0.25 ±0.040.49 ±0.060.65 ±0.21 GKN2-transfected0.15±0.02*0.22 ±0.06*0.25±0.05*

*P<0.05 compared with untransfected cells group and empty vector group.

2.4 過(guò)表達(dá)GKN2對(duì)人胃癌MKN28細(xì)胞遷移能力的影響

顯微鏡下(放大倍數(shù)×200)觀察并計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)：從Transwell小室的上層(無(wú)血清培養(yǎng)基)經(jīng)聚碳酸酯膜遷移到下層(血清培養(yǎng)基)的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞染成紫色，GKN2轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞數(shù)比未轉(zhuǎn)染組和空載體組顯著減少(P<0.05)(圖2)。

2.5 過(guò)表達(dá)GKN2對(duì)人胃癌MKN28細(xì)胞侵襲能力的影響

GKN2轉(zhuǎn)染組MKN28細(xì)胞中穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于未轉(zhuǎn)染組和空載體組(P<0.05)(圖3)。

A.untransfected cells group； B.empty vector group；C.GKN2-transfected group;*P<0.05 compared with untransfected cells group and empty vector group

A.untransfected cells group； B.empty vector group；C.GKN2-transfected group;*P<0.05 compared with untransfected cells group and empty vector group

3 討論

研究表明，在正常人胃黏膜中GKN2高表達(dá)，但在幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)感染直到胃部腫瘤形成的過(guò)程中，GKN2呈現(xiàn)出表達(dá)逐漸下調(diào)，且根除Hp后，GKN2表達(dá)上調(diào)是最明顯的[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，GKN2在胃癌遠(yuǎn)端胃黏膜中顯著高表達(dá)，而在癌旁組織和胃癌組織中呈漸進(jìn)性的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明GKN2參與胃癌的發(fā)生過(guò)程，可能作為候選抑瘤基因發(fā)揮作用，因此在胃癌中表達(dá)明顯下調(diào)。

GKN2在胃癌細(xì)胞系中均表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)[7]。那么使GKN2恢復(fù)表達(dá)是否具有抑制胃癌細(xì)胞的增殖的作用？基于此，本實(shí)驗(yàn)將GKN2高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到人胃癌MKN28細(xì)胞中，證實(shí)細(xì)胞增殖明顯受到抑制。有研究者發(fā)現(xiàn)STAT3信號(hào)通路是調(diào)節(jié)GKN2轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵點(diǎn)之一[5]，由此推測(cè)GKN2抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用是否與STAT3有關(guān)？在哺乳動(dòng)物體內(nèi)GKN2是否也具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用呢？GKN2是通過(guò)哪些信號(hào)途徑來(lái)抑制胃癌細(xì)胞增殖的呢？這些都有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

目前研究已經(jīng)證實(shí)，GKN1可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[8]，那么GKN2是否也有相同的作用呢？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GKN2過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲有顯著阻滯作用，說(shuō)明GKN2與GKN1一樣具有抑制胃癌細(xì)胞遷移與侵襲作用。遷移和侵襲的活化是癌轉(zhuǎn)移起始的標(biāo)志之一。侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程極其復(fù)雜，包括癌細(xì)胞分泌多種蛋白酶對(duì)抗細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解。最近有報(bào)道發(fā)現(xiàn)GKN2可抑制胃癌細(xì)胞EMT(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換)，其機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路下調(diào)snail的表達(dá)[9]。GKN2也可能通過(guò)與TFF1相互作用協(xié)同起到抗胃癌細(xì)胞增殖和促凋亡的作用[10]。GKN2抑制胃癌細(xì)胞遷移與侵襲的機(jī)制還未完全闡明，將進(jìn)一步進(jìn)行探究。根據(jù)以上研究結(jié)果，認(rèn)為GKN2在胃癌中是一個(gè)有潛力的腫瘤抑制基因，恢復(fù)GKN2表達(dá)也許是治療胃癌的新策略。詮釋GKN 2的作用機(jī)制將有助于進(jìn)一步闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)胃癌防治的分子靶點(diǎn)提供依據(jù)，因此值得進(jìn)一步深入開(kāi)展研究。

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