沈 沅，陳忠杰，曾夢華

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 1.藥學部； 2.胃腸外科, 重慶 400016； 3.重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院, 重慶 400060)

鹽酸奧昔布寧(oxybutynin hydrochloride)作為第3代治療尿失禁首選藥物，具有溫和的抗膽堿能力和很強的抗平滑肌痙攣作用，對泌尿生殖道平滑肌有較強選擇性[1]。鹽酸奧昔布寧經(jīng)口服吸收迅速，但存在首過代謝明顯等不利特點[2]。2009年美國FDA批準奧昔布寧凝膠制劑Gelnique上市[3]，它通過經(jīng)皮給藥避免了以上藥動學缺陷，可獲得穩(wěn)定的血藥濃度，成為國內(nèi)研制奧昔布寧經(jīng)皮給藥的標準參照制劑。

由于目前國內(nèi)尚無奧昔布寧經(jīng)皮給藥制劑上市，研制奧昔布寧經(jīng)皮給藥具有重大的臨床意義和經(jīng)濟價值，大量制劑研究成為熱點[4- 5]。其中由于凝膠劑使用方便且不易引起瘙癢等皮膚刺激，成為新劑型開發(fā)的首選[3]。

為了研究鹽酸奧昔布寧凝膠的非臨床藥動學特點，實驗選用家兔為經(jīng)皮給藥模型動物。已報道的血漿奧昔布寧測定方法主要以液-液萃取[6]和固相萃取法[7]處理樣品。本研究經(jīng)過綜合考察，建立了專屬性強，靈敏度好、準確性高且簡便和經(jīng)濟的測定家兔血漿中奧昔布寧濃度的方法，完成了自制品與國外上市制劑Gelnique的非臨床生物等效性評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：鹽酸奧昔布寧對照品(威海迪素制藥有限公司)；鹽酸苯海拉明對照品(中國藥品生物制品檢定所)；自制鹽酸奧昔布寧凝膠(重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責任公司)；鹽酸奧昔布寧凝膠國外上市品Gelnique(Watson公司)；甲醇和乙腈(國藥集團化學試劑有限公司)；叔丁基甲醚(Sigma-Aldrich公司)。

1.1.2 實驗動物：16只普通級雄性新西蘭白兔，體質(zhì)量2～2.5 kg[重慶市中藥研究院實驗動物研究所，生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012- 0007]，在重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責任公司動物房飼養(yǎng)2周后進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 色譜和質(zhì)譜檢測條件：色譜柱采用Kinetex C18100A柱(2.1 mm×50 mm，2.6 μm，Phenomenex)；流動相為水相(1‰甲酸- 10 mmol/L乙酸銨緩沖液)-乙腈50:50 (V/V)，流速0.2 mL/min。采用(+)ESI模式獲得離子原，參數(shù)如下：Capillary 4 000 V, Gas flow 9 L/min, Neb Press 30 psi, Gas Temp 300 ℃。多反應(yīng)檢測(multiple reaction monitoring, MRM)模式下定量，參數(shù)如下：奧昔布寧的transition為m/z 358.3→142.1，F(xiàn)ragmentor 135,Collision 為20；苯海拉明的transition為m/z 256.1→167.2，F(xiàn)ragmentor 135,Collision 為5。奧昔布寧和內(nèi)標苯海拉明的質(zhì)譜圖(圖1)。

1.2.2 標準品溶液配制：稱取鹽酸奧昔布寧20.2 mg，甲醇溶解并稀釋成濃度為10、50、100、250、500、1 000和2 000 μg/L的系列標準工作溶液。稱取內(nèi)標鹽酸苯海拉明20.1 mg, 甲醇溶解并稀釋為50 μg/L的內(nèi)標工作溶液。

1.2.3 血漿標準曲線及質(zhì)控樣品配制：取7份空白家兔血漿，每份0.45 mL，分別加入鹽酸奧昔布寧系列標準工作液50 μL，得濃度梯度為200、100、50、25、10、5和1 μg/L 的含藥血漿溶液。同樣，制備血漿高、中和低濃度(200、25和1 μg/L)質(zhì)控樣品(quality control, QC)，用于方法學考察和隨行樣本測定。

1.2.4 血漿樣品處理：取家兔血漿樣品0.5 mL置于10 mL玻璃離心管中，加入50 μL含50 μg/L鹽酸苯海拉明的內(nèi)標工作溶液，渦旋混合10 s。離心管中加入0.5 mol/L的NaOH水溶液50 μL堿化血樣，混合后再加入叔丁基甲醚5 mL，充分渦旋1.5 min后, 3 000 r/min離心5 min。準確移取上清液4 mL于另一離心管中，氮氣吹干。殘渣用100 μL流動相復溶，取20 μL進行測定。

1.2.5 方法學驗證：生物樣本測定方法學的驗證按照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的指導原則執(zhí)行[8]。分別對家兔空白血漿，空白血漿+鹽酸奧昔布寧+內(nèi)標樣品，家兔給藥后血漿+內(nèi)標樣品進行測定。色譜圖中無內(nèi)、外源性物質(zhì)干擾奧昔布寧和內(nèi)標苯海拉明的測定即視為方法特異性合格。

將血漿標準曲線樣品按1.2.4項測定后， 以奧昔布寧峰面積與內(nèi)標(internal standard, I.S.)峰面積之比為縱坐標，對應(yīng)的血漿鹽酸奧昔布寧濃度為橫坐標作圖并進行加權(quán)最小二乘法回歸擬合，計算相關(guān)系數(shù)r和標準曲線方程；以標準曲線最低點作為最低定量限(lower limit of quantitation, LLOQ)。

圖1 奧昔布寧(A)和內(nèi)標苯海拉明(B)的全掃描質(zhì)譜圖Fig 1 Full scan mass spectrum of oxybutynin (A) and diphenhydramine (B)

配制QC血漿樣品，每個濃度5份樣本，按1.2.4項處理并連續(xù)進行3個批次的測定，用標準曲線計算出各濃度，考察批內(nèi)和批間精密度和準確度。

配制QC樣品各5份，按照1.2.4項對每份樣品進行液-液萃取，進樣測定并記錄峰面積A；另用流動相配制與QC濃度一致的鹽酸奧昔布寧溶液，直接進樣分析得峰面積B；再將以上鹽酸奧昔布寧溶液加入到空白血漿提取后的殘留物(基質(zhì))中，混合后進樣測定并記錄峰面積C。色譜峰面積A/C×100%為奧昔布寧的提取回收率，色譜峰面積C/B×100%為奧昔布寧的基質(zhì)效應(yīng)。實驗還分別測定了QC濃度含藥血漿在室溫(12 h)、冷凍(-40 ℃，30 d)和兩次凍融(-40 ℃～25 ℃)條件下的穩(wěn)定性和血漿經(jīng)預處理后儀器內(nèi)放置24 h 的穩(wěn)定性。

1.2.6 家兔生物等效性實驗:動物試驗采用平行設(shè)計，隨機分為T和R兩組。T組家兔，于背部物理脫毛后給予自制鹽酸奧昔布寧凝膠，R組家兔以相同方法給予Gelnique，單次給藥0.5 mL，約含鹽酸奧昔布寧0.44 g。于給藥前及給藥后10、20及40 min和1、2、4、6、8、12、16、20、24、30、36及48 h于家兔耳緣靜脈處取血1.5 mL，肝素抗凝，3 000 r/min離心5 min后分離血漿，置-40 ℃冰箱內(nèi)保存待測。

1.3 數(shù)據(jù)處理與藥動學參數(shù)計算

用EXCEL軟件對方法學考察數(shù)據(jù)進行分析計算，精密度用相對標準偏差(RSD)表示，準確度用實測濃度與理論濃度比值(%)表示。采用DAS2.0軟件進行藥物動力學參數(shù)擬合，繪制藥時曲線。對受試組和參比組AUC0-t、AUC0-∞及Cmax進行雙向單側(cè)t檢驗及(1-2a，a=0.05)置信區(qū)間法等效分析，對tmax進行Wilcoxon非參數(shù)檢驗，評價自制凝膠和Gelnique的生物等效性。

2 結(jié)果

2.1 分析方法學驗證

2.1.1 特異性與線性:奧昔布寧和苯海拉明的保留時間分別為2.7和1.9 min，待測濃度范圍內(nèi)，色譜曲線平滑無內(nèi)外源性物質(zhì)干擾(圖2)。鹽酸奧昔布寧的線性范圍為1 μg/L～200 μg/L，最低定量限為1 μg/L。標準曲線方程y=0.0014c+0.007(r=0.9977)。

A.a blank rabbit plasma sample; B.a rabbit plasma spiked with oxybutynin (50 μg/L) and diphenhydramine (5 μg/L); C.a rabbit plasma sample from 2 h after administration of oxybutynin chloride gel spiked with IS

圖2LC/MS/MS法測定血漿中奧昔布寧和內(nèi)標苯海拉明的典型MRM色譜圖
Fig2TypicalMRMchromatogramsofoxybutyninanddiphenhydramine(IS)inrabbitplasmabyLC-MS/MS

2.1.2 靈敏度、精密度、準確度和穩(wěn)定性:各濃度水平QC樣品的批內(nèi)RSD介于2.13%～6.29%，批間RSD介于1.67%～9.79%，準確度在92.9%～103%；在LLOQ濃度下的批內(nèi)和批間RSD值分別為6.29%和9.79%，準確度為92.9%，均符合樣品分析要求。含藥血漿樣品在室溫、冷凍、凍融及血漿處理后儀器中放置24 h等條件下表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，準確度在94.8%～104%，RSD均小于11.4%，符合分析方法驗證要求(表1)。

2.1.3 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng):3個質(zhì)控水平的奧昔布寧提取回收率在67.5%～78.6%。基質(zhì)效應(yīng)范圍介于91.3%～104.1%。本測定方法的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均滿足樣品分析的要求(表2)。

表1 LC-MS/MS法測定家兔血漿奧昔布寧的準確度、精密度和穩(wěn)定性Table 1 Accuracy, precision, and stability of oxybutynine in rabbit plasma by n=5)

表2 LC-MS/MS法測定奧昔布寧的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

2.2 透皮制劑家兔生物等效性研究

實驗測定了T和R兩組家兔單次經(jīng)皮給藥后48 h內(nèi)的血漿奧昔布寧濃度。采用DAS2.0軟件，非房室模型計算藥代動力學參數(shù)，平均藥時曲線(圖3)和藥代動力學參數(shù)(表3)。

圖3 自制鹽酸奧昔布寧凝膠(T組)與Gelnique(R組)家兔平均藥時曲線圖Fig 3 Mean plasma concentration-time profile of oxy- butynin after administration of test oxybutynin chloride gel (T group) and reference product Gelnique (R group) to n=8)

parameterTmax/hourt1/2/hourCmax/(μg/L)AUC0-t/(μg/L·h)test product1.46±0.599.2±5.6112.4±19.41 232±140reference product1.79±1.088.2±3.2122.6±28.31 347±389

AUC0-t的(1-2a)%置信區(qū)間為96.5%～101.9%，Cmax的(1-2a)%置信區(qū)間為94.9%～101.9%，均落于等效標準80%～125%[9]。以上結(jié)果表明，采用平行設(shè)計，家兔單劑量經(jīng)皮給予0.44 g奧昔布寧凝膠后，自制凝膠和Gelnique具有生物等效性。

3 討論

為建立一種簡便、選擇性好和靈敏度高的LC-MS/MS方法，本研究進行了大量條件摸索與優(yōu)化。通過對乙酸乙酯、乙醚、叔丁基甲醚和正己烷等幾種有機液的比較，選擇了提取回收率高、揮發(fā)性好、殘余物背景干凈的叔丁基甲醚作為萃取液。與報道的反萃取方法[6]相比，本方法步驟簡單且快速。與報道的固相萃取法[7]相比操作簡便，耗時短，且無需消耗價格昂貴的萃取小柱。

目前用于藥物透皮吸收評價的常用實驗動物有大鼠、豚鼠、豬及家兔等[10]。據(jù)報道[11]，確定采用體型較大、價格便宜和操控性較好的新西蘭白兔為實驗動物。設(shè)定給藥部位為家兔背部，用電動剃刀脫毛，再將藥物涂敷于裸露皮膚。為防止家兔舔舐抓撓給藥部位，需固定在兔盒中一段時間，待凝膠揮干后方可放回籠內(nèi)。

本實驗設(shè)計達峰前3個采樣點，采血時間持續(xù)到48 h，可覆蓋家兔藥動學的吸收、分布和消除相。家兔給藥后，奧昔布寧吸收迅速，達峰時間約1.5 h，之后血藥濃度下降，并在4～16 h呈現(xiàn)一個穩(wěn)定狀態(tài)，20 h后血藥濃度緩慢下降。原因可能是家兔皮膚滲透性比人體皮膚大，在含10%乙醇凝膠的促滲作用下奧昔布寧被迅速吸收，待乙醇揮發(fā)后，奧昔布寧吸收進入家兔體內(nèi)的速度放緩，藥時曲線呈現(xiàn)一段平臺期，最后緩慢消除。比較自制凝膠和Gelnique在家兔體內(nèi)的藥動學曲線，兩者具有相似的透皮吸收特征。

奧昔布寧透皮制劑相對于口服制劑有著明顯的藥動學和藥效學優(yōu)勢，且使用方便，順應(yīng)性好。本文建立的LC-MS/MS法成功應(yīng)用于奧昔布寧透皮凝膠的家兔藥代動力學研究，并為同類仿制制劑提供了國外上市品的家兔藥動學數(shù)據(jù)參照。

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