徐 超，王春梅，白 波*

(1.山東大學(xué) 齊魯醫(yī)學(xué)部，山東 濟(jì)南 250012; 2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)研究所，山東 濟(jì)寧 272067)

在4.5 h內(nèi)靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑(recombiant human tissue type plasminogen activator，rt-PA)是處理急性缺血性腦卒中最有效方式。由于相對(duì)嚴(yán)格的適應(yīng)癥及禁忌癥，接受溶栓治療的患者比例較低[1]。在溶栓后，由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性和線粒體功能障礙等，使再灌注后的腦組織發(fā)生繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致患者多數(shù)預(yù)后不佳[2]。因此，研究能夠減輕腦缺血再灌注損傷的新型藥物很重要。

在大鼠下丘腦腹外側(cè)核中首先發(fā)現(xiàn)食欲素(orexin)，它主要在攝食、能量代謝和睡眠-覺醒等生理功能中發(fā)揮作用。其前體經(jīng)過剪接修飾產(chǎn)生食欲素-A(OXA)與食欲素-B(OXB)。兩者作用于腦內(nèi)廣泛分布的受體發(fā)揮作用， 食欲素-B可與食欲素1型受體(OX1R)和食欲素2型受體(OX2R)結(jié)合[3]。 食欲素-A在發(fā)作性睡病、抑郁癥和阿爾茨海默病等疾病中起到神經(jīng)保護(hù)作用[4- 6]。但對(duì)食欲素-B的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)在腦缺血再灌注后的大鼠模型，通過側(cè)腦室注射食欲素-B，探討食欲素-B在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，鼠齡7～8周，體質(zhì)量200～230 g[濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK(魯)20140007]。

1.1.2 主要試劑：Orexin-B(Phoenix Pharmaceuticals公司)；Orexin receptor 2抗體、AKT抗體、p-AKT抗體、p-GSK- 3β抗體及二抗羊抗鼠和羊抗兔抗體(Cell Signaling Technology公司)； 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理：隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組(control)、缺血再灌注組(I/R)、缺血再灌注+PBS組(I/R+PBS)和缺血再灌注+orexin-B組(I/R+OXB)。制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occulusion，MCAO)模型[7]，進(jìn)行Zea-Longa 5級(jí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分以確定模型是否制備成功，于腦缺血2 h后再灌注24 h。在再灌注早期(20 min)注射10 μL的食欲素-B，其濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定為1 μg/μL。

1.2.2 TTC染色檢測(cè)腦梗死體積： TTC是一種脂溶性光敏感復(fù)合物，常用來檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗死狀態(tài)?；罴?xì)胞內(nèi)的脫氫酶將TTC還原為紅色甲瓚化合物TPF(1,3,5-triphenylformazan)[8]。對(duì)于缺血組織，因脫氫酶活力喪失呈現(xiàn)蒼白色，而正常組織呈深紅色。為排除梗死側(cè)大腦水腫對(duì)計(jì)算的影響，采用公式：非梗死側(cè)半球面積-梗死側(cè)半球正常腦組織面積/非梗死側(cè)半球面積×100%，計(jì)算半球腦梗死比并評(píng)估腦梗死程度。

1.2.3 Western blot檢測(cè)大鼠損傷側(cè)大腦海馬OX2R、p-AKT和p-GSK- 3β蛋白表達(dá)： 提取損傷側(cè)海馬蛋白，根據(jù)所測(cè)蛋白濃度決定待測(cè)樣品上樣體積，進(jìn)行SDA-PAGE蛋白凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。經(jīng)抗體孵育后，加ECL試劑置于凝膠成像儀中顯色并留存圖片，用Image J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)：模型制作成功后1周，進(jìn)行大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)[9]。本實(shí)驗(yàn)使大鼠在箱內(nèi)自由適應(yīng)3 min，共適應(yīng)3次，間隔30 min。訓(xùn)練24 h后，記錄動(dòng)物自放上平臺(tái)后至跳下平臺(tái)的潛伏期、5 min內(nèi)跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù), 此為動(dòng)物的最終記憶成績。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Orexin-B明顯降低腦缺血再灌注大鼠的腦梗死體積

I/R組較對(duì)照組有明顯梗死灶。I/R+OXB組較I/R組和I/R+PBS組，梗死區(qū)域面積顯著減小(P<0.05)(圖1)。

A.TTC staining；B.infarct size ratio in different groups；*P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS

2.2 各組大鼠海馬組織OX2R、p-AKT、p-GSK- 3β的蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，I/R組海馬中OX2R及p-AKT顯著降低(P<0.05)，而p-GSK- 3β升高(P<0.05)。IR+OXB組上述指標(biāo)均變化明顯緩解(P<0.05)。(圖2，表1)

圖2 比較大鼠海馬組織中OX2R、p-AKT和pGSK-3β的蛋白表達(dá)Fig 2 Comparison of the expression of OX2R, p-AKT, p-GSK- 3βin hippocampus of rats in four groups

2.3 各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)

I/R組較對(duì)照組潛伏期時(shí)間縮短，而錯(cuò)誤次數(shù)增多(P<0.05)，而I/R+OXB組上述改變顯著減輕(P<0.05)。

表1 比較4組大鼠海馬OX2R、p-AKT和p-GSK- 3β的蛋白表達(dá)變化

△P<0.05 compared with contral;#P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS.

表2 4組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù)比較

△P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS.

3 討論

GSK- 3β是一種參與糖代謝、細(xì)胞增殖和凋亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[10]。在體內(nèi)它受AKT信號(hào)通路調(diào)控，當(dāng)AKT活化后，可磷酸化GSK- 3β的Ser9殘基，從而抑制GSK- 3β的活性，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。有報(bào)道食欲素神經(jīng)元屬于葡萄糖敏感型神經(jīng)元，血糖較低時(shí)，該神經(jīng)元被刺激而活化[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典MCAO模型模擬大腦缺血再灌注狀態(tài)，并在治療期內(nèi)側(cè)腦室注射食欲素-B，發(fā)現(xiàn)食欲素-B治療組腦梗死體積較損傷組明顯減少，表明食欲素-B可以減輕腦缺血再灌注后的損傷；實(shí)驗(yàn)還表明損傷組食欲素受體2的蛋白表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)，提示該受體參與損傷過程，治療組較損傷組相比，受體數(shù)量升高，表明食欲素-B可抑制腦缺血再灌注損傷。治療組p-AKT蛋白表達(dá)升高，p-GSK- 3β蛋白表達(dá)下降，表明食欲素-B可能通過活化下游的AKT，增強(qiáng)磷酸化，抑制p-GSK- 3β的活性，繼而抑制糖原合成及促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，觀察到食欲素-B治療組的潛伏期較損傷組延長，錯(cuò)誤次數(shù)減少，表明治療組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較損傷組明顯提升，趨利避害的認(rèn)知能力得到加強(qiáng)。

綜上，初步證明腦缺血再灌注后食欲素受體增多，參與細(xì)胞凋亡，食欲素-B可能通過激活p-AKT,降低下游p-GSK- 3β的活性從而抑制糖原合成，升高腦血管中血糖濃度，抑制神經(jīng)元凋亡。食欲素-B能提高p-AKT活性，抑制p-GSK- 3β活性，有望成為治療腦缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)藥物，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

[1] Baharoglu MI, Brand A, Koopman MM,etal. Acute management of hemostasis in patients with neurological injury [J]. Transfus Med Rev, 2017, 31: 236- 244.

[2] Vivien D. Can the benefits of rtPA treatment for stroke be improved? [J]. Rev Neurol (Paris), 2017, 173: 566- 571.

[3] Ardeshiri MR, Hosseinmardi N, Akbari E. The effect of orexin 1 and orexin 2 receptors antagonisms in the basolateral amygdala on memory processing in a passive avoidance task [J]. Physiol Behav, 2017, 174:42- 48.

[4] James MH, Campbelle EJ, Dayas CV. Role of the Orexin/Hypocretin system in stress-related psychiatric disorders [J]. Curr Top Behav Neurosci, 2017,33:197- 219.

[5] Mayo MC, Deng JC, Albores J,etal. Hypocretin deficiency associated with narcolepsy type 1 and central hypoventilation syndrome in neurosarcoidosis of the hypothalamus [J]. J Clin Sleep Med, 2015, 11: 1063- 1065.

[6] Gabella A, Jaussent I, Hirtz C,etal. Cerebrospinal fluid levels of orexin-A and histamine, and sleep profile within the Alzheimer process [J]. Neurobiol Aging, 2017, 53:59- 66.

[7] Tewari VK, Bhosale V, Shukla R,etal. Intracarotid sodium nitroprusside on fifth post ischemic stroke day in middle cerebral artery occlusion rat model [J]. J Clin Diagn Res, 2017, 11: AF01-AF04.

[8] Xin Q, Cheng B, Pan Y,etal. Neuroprotective effects of apelin- 13 on experimental ischemic stroke through suppression of inflammation [J]. Peptides, 2015, 63：55- 62.

[9] 趙嵐,董銀華,王洪新,等.糖調(diào)節(jié)受損大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,35:1235- 1239.

[10] Amy W, Andrey U, Sunandana C,etal. Molecular pathways: revisiting glycogen synthase kinase- 3β as a target for the treatment of cancer [J]. Clin Cancer Res,2017, 23:1891- 1897.

[11] Goforthp B, Myers MG, JR. Roles for Orexin/Hypocretin in the control of energy balance and metabolism [J]. Curr Top Behav Neurosci, 2017,33:137- 156.