王珺怡，朱建強(qiáng)，賈德政，袁 新，帕孜麗耶·亞森，關(guān)亞群，梁小弟

(新疆醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830002)

無義介導(dǎo)的mRNA 降解 (nonsense mediated mRNA decay, NMD) 是一種廣泛存在于真核生物中的一種高度保守的RNA 監(jiān)控機(jī)制[1- 2]。NMD的主要功能是監(jiān)控異常轉(zhuǎn)錄本，包括含有提前終止密碼子 (premature termination codon, PTC)的轉(zhuǎn)錄本、含有上游開放讀碼框 (upstream open reading frame,

uORF) 的轉(zhuǎn)錄本以及含有長3端非翻譯區(qū) (3′UTR) 的轉(zhuǎn)錄本等[3- 4]。

肥胖是各種代謝性疾病及心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，肥胖發(fā)生過程中脂肪組織的代謝改變是最為重要的生物化學(xué)變化[5]。脂肪細(xì)胞的正確分化受到了基因表達(dá)不同層次的共同調(diào)控[6]。在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ) 表達(dá)升高可以作為前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志之一[7]。在轉(zhuǎn)錄后水平，hnRNA會經(jīng)歷一系列的轉(zhuǎn)錄后加工過程，進(jìn)而形成能夠編碼蛋白的成熟的mRNA[8]。因此，了解脂肪細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)機(jī)制對認(rèn)識脂肪細(xì)胞分化及肥胖的發(fā)生有重要的意義[9]。

為闡明在脂肪細(xì)胞分化過程中NMD途徑的激活情況，本研究利用體外原核表達(dá)含有小鼠上游移碼因子1(up-frameshift protein 1, UPF1)蛋白C端550個氨基酸的多肽，制備抗小鼠UPF1蛋白的抗體并進(jìn)行效價及特異性檢測。進(jìn)而，利用該抗體檢測小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞分化過程中UPF1蛋白的表達(dá)情況及其與UPF2蛋白的互作情況，為今后在脂肪細(xì)胞分化過程中探索NMD機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞系：大腸桿菌DH5α感受態(tài)和大腸桿菌BL21感受態(tài)(天根生物公司)；質(zhì)粒pMD- 19T(TaKaRa公司)；質(zhì)粒pET- 28a(+)和小鼠3T3-L1細(xì)胞系由本實驗室保存。

1.1.2 試劑：限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、T4連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和High Range Protein Ruler(Thermo公司)；LB培養(yǎng)基和DNA Ladder 2K(天根生物公司)； PCR mix(TaKaRa公司)；KOD taq(Toyobo公司)；Anti-ACTIN ab(Santa Curz公司)；Protein G-Sephorose(Boehringer Mannheim公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組pMD- 19T-mUPF1 550及pET- 28a(+)-mUPF1 550載體的構(gòu)建及鑒定：對小鼠UPF1蛋白(NP_109605.2)進(jìn)行同源性、親水性及抗原表位分析，選定靠近該蛋白C端的550個氨基酸作為抗原表位。對小鼠Upf1 mRNA(NM_030680.3)序列分析，并選2個酶切位點BamHⅠ及HindⅢ。根據(jù)該段序列及選定的酶切位點設(shè)計正向引物: 5′-C GCGGATCCatgagtgtggaggcgtacggcccc-3′大寫部分為BamHⅠ酶切位點及保護(hù)堿基；反向引物：5′-CCC AAGCTTtcactcaatagcaatctcatcaccata-3′大寫部分為HindⅢ酶切位點及保護(hù)堿基。以小鼠3T3-L1細(xì)胞系mRNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，用高保真酶KOD進(jìn)行PCR，條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min共35個循環(huán)后降溫到4 ℃ 收樣，電泳鑒定并純化后進(jìn)行TA克隆，對重組體酶切鑒定后挑選2～3個克隆進(jìn)行測序鑒定。選取測序正確的克隆進(jìn)行HindⅢ及BamHⅠ酶切，將酶切后的片段與pET28a載體連接，對獲得的重組體進(jìn)行酶切鑒定后，選取正確的載體再次測序，最終測序正確的載體作為構(gòu)建成功的重組體(pET- 28a-mUPF1 550)保存。

1.2.2 mUPF1- 550aa多肽表達(dá)、純化及鑒定：將測序正確的pET28a-mUPF1 550的載體轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單克隆，加入含有卡那霉素LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、培養(yǎng)至A值在0.8左右，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，26 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌液，溶菌酶酶解30 min，超聲破碎，取上清過鎳柱純化。將洗脫產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色并脫色，截取蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.2.3 動物免疫：選取雄性新西蘭大白兔2只進(jìn)行背部皮下多點注射免疫。

1.2.4 ELISA 法檢測抗體效價：分別在免疫的第15天和第35天進(jìn)行耳緣靜脈取血，37 ℃保溫箱中孵育1 h，4 ℃，8 000 r/min離心7 min收集血清。向酶標(biāo)板每孔中加入100 μL濃度為1‰的抗原包被液，4 ℃過夜孵育。次日取出酶標(biāo)板，去除液體并洗滌酶標(biāo)板4次；每孔加300 μL 封閉液于37 ℃保溫箱中孵育2 h。加入用抗原稀釋液進(jìn)行梯度稀釋的抗mUPF1多抗(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000和1∶32 000)100 μL/孔，同時設(shè)置陰性對照(1∶2 000稀釋免疫前血清)、陽性對照(1∶1 000稀釋抗體)及空白對照(只加抗原稀釋液)；37 ℃保溫箱中孵育1 h，孵育后洗滌3次。加入用0.01 mol/L PBS作1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。洗板3次，加顯色液100 μL/孔，37 ℃孵育15 min 后100 μL/孔加終止液(2 mol/L H2SO4)終止反應(yīng)。450 nm下酶標(biāo)儀檢測吸光度值，記錄實驗結(jié)果，分析抗體效價。在兔血清達(dá)到一定的效價后，采用頸動脈放血的方法收集兔全血，分離血清后利用Protein G Sepharose純化，-80 ℃保存。

1.2.5 小鼠3T3-L1細(xì)胞系的體外誘導(dǎo)分化：將小鼠3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。第2天將培養(yǎng)基換為含有10% FBS、0.25 μmol/L地塞米松、250 nmol/L胰島素及0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，第3天換為含有10% FBS及250 nmol/L胰島素的DMEM培養(yǎng)基。第0天(control)為加入誘導(dǎo)劑前的當(dāng)天，第2天為加入誘導(dǎo)劑后的第2天，依次類推。分別取第0天、第2天、第4天及第8天的細(xì)胞作為研究對象。

1.2.6 3T3-L1的誘導(dǎo)分化后Upf1及Pparγ基因的表達(dá)：用Trizol試劑提取培養(yǎng)好的3T3-L1細(xì)胞總RNA。10 μg總RNA用于變性膠電泳，檢測RNA的完整性；按照Fermentas公司的Maxmia Reverse Transcriptase kit操作說明合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實時定量PCR，最終結(jié)果以28 s rRNA為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最終得到靶基因的2-ΔΔCt值。在蛋白提取、定量及Western blot操作中，每次上樣蛋白為30 μg，使用不同的一抗(不同的抗體稀釋濃度Anti-PPARγ 1∶1 500，Anti-UPF1 1∶2 000)進(jìn)行孵育。曝光采用chemiluminescence (ECL, Amersham Pharmacia)系統(tǒng)曝光。

1.2.7 UPF1蛋白與UPF2蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，CoIP)：對上述時間點的細(xì)胞加入含有蛋白酶抑制劑的Tris甘油緩沖液，在冰上用細(xì)胞刮刀反復(fù)刮取細(xì)胞，冰上放置10 min后吸取細(xì)胞裂解產(chǎn)物，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min后吸取上清，測定蛋白濃度后，取30 μg蛋白配制成1 μg/μL的Input樣品，并加入SDS上樣緩沖液變性備用。剩余蛋白提取液中取1 mg蛋白并用Tris甘油緩沖液配制成1.2 mL的蛋白提取液。配制完成后，每管提取物中加入3 μg相應(yīng)抗體。將CoIP后的樣品和Input樣品一起上樣電泳，并分別用Anti-UPF1 Ab及 Anti-UPF2 Ab進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 pET- 28a(+)-UPF1 550載體的酶切鑒定

重組pET- 28a-UPF1 550載體經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，得到大小1 650 bp的upf1編碼序列及大小為5 369 bp的線性pET28a載體(圖1)。

1.DNA Ladder 5 000; 2,3.identification of the linearized plasmid pET- 28a by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ digestion; 4,5.identification of recombinant plasmid pET- 28a-UPF1 550 by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ digestion圖1 pET- 28a-UPF1 550重組體酶切鑒定Fig 1 Double digestion of pET- 28a-UPF1 550 constrution

2.2 UPF1蛋白C端550個氨基酸肽段的表達(dá)及純化

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，UPF1的抗原純度達(dá)到98%(圖2)。

1.protein marker; 2.the E. coli protein before the induction; 3.the E. coli protein after the induction; 4.UPF1 protein after purification圖2 UPF1蛋白C端550個氨基酸肽段的表達(dá)與純化Fig 2 Expression and purification of the C terminal of UPF1 protein

2.3 UPF1抗體效價的檢測

通過ELISA檢測，UPF1抗體在第15天的效價約為320 000，而第35天的效價達(dá)到640 000(圖3)。

2.4 小鼠3T3-L1細(xì)胞系成脂誘導(dǎo)過程中UPF1的表達(dá)及與UPF2的互作情況

用成脂誘導(dǎo)劑對小鼠3T3-L1細(xì)胞系進(jìn)行誘導(dǎo)后，用油紅O染色見隨著誘導(dǎo)分化時間的增加，脂滴逐漸增多(圖4A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，upf1 mRNA水平未隨著細(xì)胞的成脂發(fā)生變化(圖4B)。免疫印跡結(jié)果同樣顯示，UPF1蛋白在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)沒有發(fā)生變化(圖4C)。免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)分化的第4天UPF1蛋白與UPF2蛋白結(jié)合增加，并且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖4D)。

3 討論

NMD途徑通過降解異常轉(zhuǎn)錄本防止截短蛋白產(chǎn)生以維持細(xì)胞正常的生理功能，該途徑中，UPF1與UPF2蛋白相結(jié)合后使UPF1位點暴露， 易于SMG1對UPF1的磷酸化，磷酸化后的UPF1可將含有PTC的轉(zhuǎn)錄本降解。因此， 可用UPF1與UPF2的結(jié)合量間接反應(yīng)NMD途徑的激活情況。本研究以小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞為實驗?zāi)Ｐ?，通過成脂誘導(dǎo)分化模擬在體內(nèi)的脂肪分化，通過檢測該過程中UPF1與UPF2的結(jié)合量探索NMD途徑在脂肪細(xì)胞分化過程中的激活情況。成脂誘導(dǎo)劑對小鼠3T3-L1細(xì)胞系進(jìn)行誘導(dǎo)后，油紅O染色，可見隨著誘導(dǎo)分化時間的增加，脂滴逐漸增多，說明3T3-L1細(xì)胞系在成脂誘導(dǎo)劑的作用下逐漸分化為成熟的脂肪細(xì)胞。RT-qPCR結(jié)果顯示，upf1 mRNA水平未隨著細(xì)胞的成脂發(fā)生變化；免疫印跡結(jié)果提示，UPF1蛋白在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)未發(fā)生變化。如前所述，NMD機(jī)制的激活需要UPF1及UPF2的相互結(jié)合，免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)分化的第4天UPF1蛋白與UPF2蛋白結(jié)合增加，說明NMD途徑在成脂過程中激活。脂肪細(xì)胞分化的過程中是一系列高度有序的過程，有證據(jù)表明基因表達(dá)的調(diào)控對該過程有決定作用。脂肪細(xì)胞分化過程中NMD途徑的激活對維持細(xì)胞的正常分化有著重要的意義，本研究也為今后在該過程中研究NMD機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

圖3 多克隆抗體UPF1的效價檢測Fig 3 Determination of polyclonal antibody UPF1 titer

A.light microscopic aspect of 3T3-L1 cell differentiation by oil-O staining，scale bar:50 μm; B.the expression level of upf1 mRNA by RT-qPCR detecting with 28S rRNA as the beta-actin; C.the expression of UPF1 protein in different differentiated phases by CoIP detecting; D.the interplays between UPF1 protein and UPF2 protein on the zeroth day and the fourth day by CoIP detecting

圖4NMD因子UPF1在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)及與UPF2的相互作用
Fig4ExpressionofNMDfactorUPF1andinteractionofUPF1andUPF2duringadipogensis(scalebar=50μm)

參考文獻(xiàn)：

[1] Popp MW, Maquat LE. The dharma of nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells [J]. Mol Cells, 2014, 37:1- 8.

[2] Lykke-Andersen J, Bennett EJ. Protecting the proteome: Eukaryotic cotranslational quality control pathways. [J]. Cell Biol, 2014, 204:467- 476.

[3] Sieber J, Hauer C, Bhuvanagiri M,etal. Proteomic analysis reveals branch-specific regulation of the unfolded protein response by nonsense-mediated mRNA decay[J]. Mol Cell Proteomics, 2016, 15:1584- 1597.

[4] Kurosaki T, Maquat LE. Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance[J]. Cell Sci, 2016, 129:461- 467.

[5] Itoh M, Suganami T, Hachiya R,etal. Adipose tissue remodeling as homeostatic inflammation[J]. Int J Inflam, 2011,2011:720926. doi: 10.4061/2011/720926.

[6] Green AC, Kocovski P, Jovic T,etal. Retinoic acid receptor signalling directly regulates osteoblast and adipocyte differentiation from mesenchymal progenitor cells[J]. Exp Cell Res, 2017, 350:284- 297.

[7] Park CH, Kim JH, Lee EB,etal. Aronia melanocarpa extract ameliorates hepatic lipid metabolism through PPARγ2 down regulation[J]. PLoS One, 2017, 12:e0169685. doi: 10.1371/journal.pone.0169685.

[8] Hu B, Yang YT, Huang Y,etal. POSTAR: a platform for exploring post-transcriptional regulation coordinated by RNA-binding proteins:[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45:D104-D114.

[9] Zhao BS, Roundtree IA, He C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2017, 18:31- 42.