趙雪晴，李　全，錢世寧，李鵬飛△

(1.江蘇省南京市婦幼保健醫(yī)院　210029；2.江蘇省中醫(yī)院，南京 210029)

抗癌藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)是腫瘤患者化療藥物中普遍使用的。但是，5-FU在患者身上的療效及毒性有顯著差異，尤其是在毒性方面不同個(gè)體差異較大，嚴(yán)重情況會(huì)出現(xiàn)致死性的腹瀉、骨髓抑制等[1-2]。機(jī)體內(nèi)的5-FU有80%～85%經(jīng)過肝臟的二氫嘧啶脫氫酶(DPD)代謝成為無活性成分排出體外[2]。研究表明5-FU的不良反應(yīng)與其代謝和清除的限速酶DPD活性密切相關(guān)[3]。隨著分子診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)參與5-FU分解代謝的DPD編碼基因的重要位點(diǎn)進(jìn)行測序，尋找出能夠指導(dǎo)臨床化療的關(guān)鍵突變，為5-FU個(gè)體化用藥提供科學(xué)依據(jù)。本研究擬檢測使用5-FU化療的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞DPD基因表達(dá)水平及突變情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2015年2月至2016年6月在江蘇省中醫(yī)院腫瘤科住院的50例直腸癌患者，經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌，治療均使用5-FU，其中化療敏感組22例，男14例、女8例，中位年齡63.2歲；化療耐藥組28例，男18例、女10例，中位年齡62.1歲。兩組患者的年齡和性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有受試者均簽署臨床試驗(yàn)知情同意書。

1.2方法

1.2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞分離按照說明書采用Ficoll分離液分離所有患者外周血單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測DPD mRNA的表達(dá)采用Trizol 法提取總RNA，使用Eppendorf核酸蛋白檢測儀測定RNA水平，隨后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL):5×PrimescriptTM緩沖液4 μL，PrimescriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 4 μL，RNase Free H2O 10 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。使用TaKaRa公司熒光定量檢測試劑盒，按照試劑說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×SYBR green 染料10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，RNase Free H2O 7 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；在延伸步驟中采集熒光信號(hào)。DPD上游引物(5′-3′)：AGG ACG CAA GGA GGG TTT G，下游引物(5′-3′)：GTC CGC CGA GTC CTT ACT GA。使用美國ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果分析用SDS software version 2.0，分析條件設(shè)置:根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值及Threshold的value值，在analysis菜單下選擇analyze自動(dòng)分析結(jié)果。β-actin作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCT)計(jì)算DPD mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3測序法檢測DPD突變檢測化療耐藥組28例患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DPD突變情況。

1.2.3.1DNA制備加入600 μL核裂解緩沖液重新懸浮細(xì)胞。加入40 μL 10%SDS，混勻。再加入10 μL 20 mg/mL的Proteinase K，5 μL 10 mg/mL的RNase A，混勻，50 ℃水浴過夜。加入200 μL 5.3 mol/L 的NaCl 溶液，混勻，13 000 r/min 4 ℃條件下離心30 min。轉(zhuǎn)移上清液到另一管中，加一倍體積4 ℃預(yù)冷的異丙醇，充分混勻?？梢娦鯛頓NA 析出。13 000 r/min 4 ℃條件下離心15 min，棄上清液。用75%的乙醇洗滌沉淀2 次，棄上清液，室溫晾干。加入適量TE 溶液溶解沉淀，-20 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2PCR及測序采用中山達(dá)安有限公司DPD點(diǎn)突變檢測試劑盒。以影響DPD活性較大的點(diǎn)突變?yōu)榘袇^(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR體外擴(kuò)增法結(jié)合測序技術(shù)，檢測對(duì)DPD活性影響較大的A74G、T85C、A1627G、T1896C、IVS14+1G>A、14G1A、G2194A點(diǎn)突變。PCR反應(yīng)體系如下：BigDye 1.5 μL，Primer 5 pmol，DNA 40～80 ng，H2O至10 μL。采用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀。反應(yīng)條件如下：96 ℃ 2 min，96 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 50 min，72 ℃ 8 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的純化:每個(gè)樣品加入31 μL 乙酸銨(30 μL 95% 乙醇，1 μL 醋酸銨)，充分振蕩混勻；15 ℃，4 000 r/min離心45 min；將樣品倒置，下面墊上吸水紙，放入離心機(jī)倒甩，轉(zhuǎn)速不要超過300 r/min；每個(gè)樣品再加入50 μL 75%乙醇；15 ℃，4 000 r/min，離心25 min；將樣品倒置，下面墊上吸水紙，放入離心機(jī)倒甩，轉(zhuǎn)速不要超過300 r/min； 避光晾干(約30 min)，每個(gè)樣品加入3 μL 上樣緩沖液。

2　結(jié)　　果

2.1各組DPD基因表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，所有患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中均可檢測到DPD mRNA的表達(dá)。化療耐藥組DPD mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.093±0.020，化療敏感組DPD mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.058±0.010，化療敏感組DPD mRNA水平明顯低于化療耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2DPD基因突變情況5-FU治療敏感及耐藥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中均未檢測到DPD突變位點(diǎn)。

3　討　　論

5-FU是一種治療癌癥的嘧啶類似物的藥物，是用于治療直腸癌的有效方案[4-6]。但有研究表明，DPD的活性可能會(huì)導(dǎo)致5-FU的藥理性質(zhì)變異[7-8]。DPD是5-FU分解、代謝和清除的限速酶，DPD活性降低或缺乏與5-FU的降解速度下降呈正相關(guān)，因此在治療使用5-FU引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)時(shí)，DPD活性越低對(duì)5-FU的不良反應(yīng)程度越高[9]。

眾多研究表明DPD表達(dá)水平與5-FU的化療療效密切相關(guān)，DPD表達(dá)水平越高，化療效果越差[10]。本研究發(fā)現(xiàn)采用5-FU化療的患者中化療敏感組DPD mRNA表達(dá)水平較化療耐藥組低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此臨床上在化療前對(duì)DPD水平進(jìn)行測量，可減少和避免不良反應(yīng)的存在，更利于臨床進(jìn)行個(gè)體化治療。

同時(shí)有研究表明個(gè)體DPD活性差異與DPD基因某些位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性相關(guān)[11]。有學(xué)者對(duì)1例化療后出現(xiàn)嚴(yán)重5-FU毒性致死女性的DPD23個(gè)外顯子進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的DPD基因位點(diǎn)T464A等位基因發(fā)生頻率約為0.2%[12]。同時(shí)有學(xué)者驗(yàn)證15種已知的DPD基因序列，新發(fā)現(xiàn)3種:G1218A、C3067T和G1236A，但發(fā)生頻率很低[13]。臨床和實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明DPD活性下降與DPD基因多態(tài)性相關(guān)[14]。國內(nèi)目前對(duì)此研究較少，因控制DPD多態(tài)性活性的分子機(jī)制較為復(fù)雜，許多化療后出現(xiàn)嚴(yán)重毒性者并未檢測到DPD基因突變[15]。本次試驗(yàn)選取幾個(gè)已報(bào)道的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，對(duì)5-FU耐藥的患者檢測也暫未發(fā)現(xiàn)DPD基因突變現(xiàn)象。通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增及測序，測定DPD基因位點(diǎn)突變情況。本研究發(fā)現(xiàn)5-FU治療敏感及耐藥患者均未檢測到突變，與國內(nèi)學(xué)者報(bào)道的結(jié)果相同[16-18]。

總的來說，DPD的基因表達(dá)水平與化療敏感性相關(guān)。相信隨著人們對(duì)DPD研究的深入，新的DPD突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)將有助于預(yù)測5-FU應(yīng)用者的毒性風(fēng)險(xiǎn)和療效，可能成為指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療的重要參考指標(biāo)。