廖春艷 綜述，李志峰，段　剛 審校

(重慶市疾病預(yù)防控制中心　400042)

流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦) 是由腦膜炎奈瑟菌(Nm)通過呼吸道傳播引起的化膿性腦膜炎，為急性呼吸道傳染病，常在冬春季引起發(fā)病與流行。腦膜炎發(fā)病迅速，病死率超過20%，且后遺癥嚴(yán)重[1]。我國90%以上的患者是由A群Nm引起。Nm是只存在于人體的需氧雙球菌，其外膜含脂多糖成分，致病性Nm的外膜外有莢膜多糖。Nm有多基因差異。根據(jù)Nm莢膜多糖的不同，分為12個(gè)血清群：A、B、C、H、I、K、L、X、Y、Z、29E、W135和不能分群菌株。Nm的病原學(xué)檢測包括細(xì)菌培養(yǎng)、革蘭染色、生化鑒定、血清學(xué)分群，乳膠凝集反應(yīng)直接檢測抗原等。腦脊液革蘭染色仍是快速檢測Nm的重要方法之一，患者淤點(diǎn)(斑)、腦脊液涂片檢測時(shí)在中性粒細(xì)胞內(nèi)見到革蘭陰性腎形雙球菌或腦脊液、血液培養(yǎng)Nm陽性或腦脊液、血液Nm特異性核酸片段檢測陽性都可作為流腦的確診依據(jù)。病原學(xué)檢測是檢驗(yàn)Nm的傳統(tǒng)方法，但因Nm對冷、熱、干燥和化學(xué)消毒劑的高度敏感性和對外環(huán)境的弱抵抗力，以及臨床標(biāo)本的采集、運(yùn)送、培養(yǎng)、接種方式、培養(yǎng)基質(zhì)量、檢測人員的經(jīng)驗(yàn)等都可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。PCR分子學(xué)診斷的優(yōu)點(diǎn)是可測出菌群特異性Nm DNA，不要求陽性結(jié)果中存在活的病原體，且結(jié)果可在2 h內(nèi)獲得[2]。目前，高敏感性、高特異性、操作簡便的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于Nm感染的檢驗(yàn)診斷。本文就Nm的檢測技術(shù)及檢測進(jìn)展作初步綜述。

1　Nm的病原學(xué)檢測技術(shù)

病原學(xué)檢測是最早應(yīng)用于細(xì)菌檢測的方法。分離出Nm是診斷流腦的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其鑒定方法包括革蘭染色、氧化酶試驗(yàn)、生化鑒定、血清學(xué)分群等。基于獲得的陽性菌株，可進(jìn)行進(jìn)一步的研究，比如體外藥物敏感試驗(yàn)就必須首先分離到陽性菌株。李馬超等[3]就曾對其實(shí)驗(yàn)室2005-2006年分離的49株Nm菌株(16株A群、33株C群)進(jìn)行體外抗菌藥物敏感性檢測，結(jié)果表明，16株A群Nm菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑、四環(huán)素、左氧氟沙星、萘啶酸4種抗菌藥物耐藥，對環(huán)丙沙星耐藥或中度敏感，33株C群Nm菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥，31株(93.9%)C群菌株對萘啶酸耐藥，20株(60.6%)C群菌株對左氧氟沙星耐藥，17株(51.5%)C群菌株對環(huán)丙沙星耐藥，4株A群和1株C群Nm菌對青霉素不敏感。馮君平等[4]進(jìn)一步探索了A群、C群Nm的最適培養(yǎng)基，結(jié)果表明添加酵母浸出粉的培養(yǎng)基可作為A 群、C 群Nm培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。鄭春早等[5]配制了一種小牛血清“雙抗”培養(yǎng)基作為Nm的增菌培養(yǎng)基，與常規(guī)檢測培養(yǎng)基比較表明，應(yīng)用小牛血清“雙抗”培養(yǎng)基建立的新方法適用于A、B、C 群Nm的檢測,且檢測效果明顯優(yōu)于常規(guī)的咽拭子直接接種法。病原學(xué)檢測的缺點(diǎn)是比較繁瑣、耗時(shí)、影響因素多，特異性可能不夠好。

2　Nm的普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

PCR是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，對于不能用血清學(xué)分群的Nm疑似菌株或無法進(jìn)行Nm分離培養(yǎng)的腦脊液、血液、血清標(biāo)本可采用PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增輔助檢測鑒定。近年來PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于Nm的檢測中[2,6]。黃亮等[7]采用普通PCR技術(shù)對流腦疑似病例的腦脊液和血液標(biāo)本中Nm種屬及各群的特異性DNA片段進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)6例流腦疑似患者的腦脊液標(biāo)本中有5份Nm屬特異性基因Crg A陽性，5份檢出Nm C群SiaD(C)基因片段；血液標(biāo)本中1份檢出Nm CrgA 基因，1份檢出Nm C 群SiaD(C)基因片段。張文艷等[8]對Nm血紅素加氧酶的基因Hemo進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，Nm標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性結(jié)果，即擴(kuò)增出長為424 bp的DNA片段，而肺炎鏈球菌、乙型流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌均未擴(kuò)增出該DNA片段，為陰性結(jié)果；PCR技術(shù)能檢測出4 pg的腦膜炎雙球菌DNA，具有高敏感性；11 份腦脊液樣品Nm PCR檢測常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果顯示，PCR檢出率為36.3%，而培養(yǎng)法的檢出率為18.2%,PCR明顯高于培養(yǎng)法(P<0.05)。徐麗等[9]則利用普通PCR技術(shù)建立了檢測29E群、X群和Z群等3個(gè)血清群Nm的方法，然后將該方法應(yīng)用于41份疑似Nm菌株標(biāo)本的檢測，結(jié)果表明，41份疑似Nm標(biāo)本中，29E群和X群PCR陽性的標(biāo)本分別有7份和2份，未檢測出Z群菌株，建立了能準(zhǔn)確、特異地鑒定29E群、X群和Z群Nm菌株的PCR方法。

3　Nm的多重(復(fù)合)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

普通PCR主要用于單一致病因子的鑒定；多重PCR反應(yīng)原理與一般PCR相同，主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定，也可用于某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。近年來，多重PCR技術(shù)越來越廣泛應(yīng)用于Nm的檢測。任紅宇等[10]針對包括Nm在內(nèi)的8種細(xì)菌的特異性基因，通過優(yōu)化單一PCR 擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序，初步建立了能同時(shí)檢測8種導(dǎo)致細(xì)菌性腦膜炎的病原體的復(fù)合PCR 擴(kuò)增方法。熊長輝等[11]應(yīng)用多重PCR技術(shù)對其實(shí)驗(yàn)室保存的70株已經(jīng)血清學(xué)鑒定的Nm 進(jìn)行核酸鑒定及基因分群，同時(shí)檢測23例流腦疑似病例腦脊液標(biāo)本中Nm特異性DNA片段，發(fā)現(xiàn)68株Nm的多重PCR檢測結(jié)果與血清學(xué)分群結(jié)果一致，2株血清學(xué)未能分群的Nm經(jīng)多重PCR檢測為C群；23 例流腦疑似病例腦脊液標(biāo)本經(jīng)多重PCR檢測有5例為C群，1例為A 群，1例為B群，陽性檢出率為30.43%，傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)鑒定4例為C群，陽性檢出率為17.39%?？梢姸嘀豍CR技術(shù)對Nm檢測的特異性優(yōu)于病原學(xué)檢測。DIAWARA等[12]應(yīng)用復(fù)合熒光實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)技術(shù)對腦脊液中的Nm和肺炎鏈球菌進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，Nm和肺炎鏈球菌的不同熔融溫度的兩峰分別為87.5 ℃、85.5 ℃。Nm和肺炎鏈球菌的RT-PCR的靈敏度分別為100%(95%CI：82.4～100.0，85.1～100.0)，二者特異度相同，均為100%(95%CI：88.6～100.0)。Nm和肺炎鏈球菌引起的腦膜炎的診斷準(zhǔn)確率分別提高到50.7%和28.6%。DE FILIPPIS等[13]利用多重PCR技術(shù)對Nm、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌進(jìn)行了檢測，總共收集了110個(gè)分離株和134例臨床標(biāo)本(99例腦脊液和35例血液標(biāo)本)并進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，所使用的方法快速、特異性好、靈敏度高。ZHU等[14]利用多重PCR技術(shù)對Nm進(jìn)行了基因分型。結(jié)果表明，其檢測靈敏度為1 ng基因組DNA(相當(dāng)于4×105基因組)，腦脊液標(biāo)本中為3×105cfu/mL，這種多重PCR檢測可能有助于臨床診斷和流腦流行病學(xué)監(jiān)測。

4　熒光定量PCR檢測Nm法

熒光定量PCR通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，通過相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始水平。雷永良等[15]應(yīng)用該技術(shù)對167例流腦監(jiān)測標(biāo)本進(jìn)行了檢測，并與傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測進(jìn)行比較，結(jié)果表明新方法與傳統(tǒng)方法陽性符合率為55.56%，另有4例傳統(tǒng)方法檢測為陰性的標(biāo)本用熒光定量PCR檢測為陽性，其特異度、靈敏度都高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，且檢測周期更短。楊艷等[16]針對Nm特異性基因por A設(shè)計(jì)引物、探針，用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，并與常規(guī)PCR比較，結(jié)果表明應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測時(shí)，64株Nm檢測結(jié)果均為陽性，6株非Nm結(jié)果均為陰性。檢測靈敏度達(dá)5.0×103cfu/mL，即5 cfu/test，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍，并且結(jié)果重復(fù)性好。張曉春等[17]采用熒光定量PCR檢測健康者咽拭子中Nm的帶菌情況，結(jié)果表明，熒光定量PCR的靈敏度、特異度均為100%，陽性預(yù)測值(PPV)為13.09%，陰性預(yù)測值(NPV)為100.00%，檢出限為0.5 cfu/50 μL體系，熒光定量PCR檢出結(jié)果的時(shí)間為3 h，而培養(yǎng)法至少要2 d。該方法可用于疾病的快速診斷，特別適合健康者的帶菌率調(diào)查。MIRONOV等[18]采用熒光定量PCR技術(shù)對Nm參考菌株和187例腦膜炎患者的腦脊液進(jìn)行研究，結(jié)果表明該方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法有更好的特異性和敏感性。文獻(xiàn)[12]也將熒光定量PCR技術(shù)與多重PCR技術(shù)結(jié)合，取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測Nm抗體水平

應(yīng)用ELISA間接法檢測患者急性期和恢復(fù)期血清中的抗體水平，如恢復(fù)期效價(jià)較急性期呈4倍或4倍以上升高，可作為流腦的輔助鑒別。ELISA間接法也可以應(yīng)用于健康者血清抗體的測定，結(jié)果可為當(dāng)?shù)氐牧髂X防控提供參考。張洪飛等[19]應(yīng)用ELISA分析了通遼市科左中旗221例健康者Nm帶菌情況及其抗體水平，檢出腦膜炎雙球菌13株，總帶菌率為3.81%；A群抗體陽性率為71.91%，C群抗體陽性率為47.51%，為該地區(qū)今后的流腦預(yù)防、控制提供了科學(xué)依據(jù)。

6　Nm的分子分型及其他新技術(shù)

多位點(diǎn)序列分型(MLST) 技術(shù)是從基因水平通過管家基因的點(diǎn)突變對Nm進(jìn)行分型，利用MLST可以對數(shù)十年前不同地區(qū)分離的菌株之間的親緣關(guān)系進(jìn)行評估，尤其是對不同菌群之間基因發(fā)生的頻繁的重組事件，分析菌株進(jìn)化關(guān)系及判斷分離株是否屬高致病性克隆系等方面，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)血清型分型方法的不足[20]。MLST適合用于長期的、大范圍的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測菌群結(jié)構(gòu)變化，研究地域性傳播和流行性變遷。兩株細(xì)菌MLST分型結(jié)果相同，表示這兩株細(xì)菌屬于相同的克隆或者克隆群，不能認(rèn)為他們之間有流行病學(xué)聯(lián)系。朱水榮等[20]采用MLST技術(shù)，對浙江省2004-2013年部分Nm菌株開展基因分型研究，得出了浙江省Nm分離株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為今后有針對性地制訂流腦預(yù)防控制措施提供參考。鄧小玲等[21]則采用MLST技術(shù)，對廣東省Nm分離株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了研究，為有針對性地采取預(yù)防控制措施提供依據(jù)。

脈沖場凝膠電泳(PFGE)是一種分離大分子DNA的方法，實(shí)踐表明，大于40 kb的DNA不能在恒強(qiáng)水平瓊脂糖凝膠電泳中分離，PFGE解決了這一難題。PFGE可以用來分離相對分子質(zhì)量10 kb到10 Mb 的DNA分子。其分型的基礎(chǔ)是大片段的插入、缺失、重組或質(zhì)粒的獲得、丟失或酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變。MOODLEY等[22]應(yīng)用PFGE技術(shù)對南非2002-2006年B群Nm克隆分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的基因克隆ST-4240/6688。邵祝軍等[23]則應(yīng)用PFGE技術(shù)對中國C群Nm分離株進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AH1是中國C群Nm主要的帶型。

在流腦調(diào)查中，上述兩種分子分型的運(yùn)用原則：暴發(fā)調(diào)查時(shí)所有菌株進(jìn)行PFGE，挑選代表菌株進(jìn)行MLST，對于流腦特異性引物PCR擴(kuò)增陽性的患者血清或者腦脊液未能分離到菌株的進(jìn)行MLST；個(gè)案調(diào)查時(shí)所有菌株進(jìn)行PFGE和MLST分型，對于流腦特異性引物PCR擴(kuò)增陽性的患者血清或者腦脊液未能分離到菌株的進(jìn)行MLST；健康攜帶情況調(diào)查及在全國范圍的、長期的流行情況調(diào)查時(shí)所有菌株進(jìn)行PFGE，挑選代表菌株進(jìn)行MLST分型。

多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)也是一種分子分型技術(shù)，其分型依據(jù)為VNTR位點(diǎn)的滑鏈突變。該方法具有較好的分辨力、重復(fù)性、分型力及可比性，操作簡單，試驗(yàn)周期為1 d。SHAN等[24]應(yīng)用MLVA技術(shù)分析了序列型為ST-4821的C群Nm引起的2010年中國山東省的流腦疫情暴發(fā)。

2000年日本學(xué)者發(fā)明了恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)。近年來該技術(shù)已成功地應(yīng)用于流腦、SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中。LEE等[25]應(yīng)用LAMP技術(shù)對腦脊液中的Nm進(jìn)行了快速鑒定，結(jié)果表明，該方法靈敏度高(比傳統(tǒng)的PCR方法高2～5個(gè)數(shù)量級(jí))，反應(yīng)時(shí)間短(30～60 min就能完成反應(yīng))。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行生命科學(xué)研究的新方法。有疾控工作者用該方法初步探索了Nm部分蛋白表型特征分析。胡源等[26]利用雙向電泳技術(shù)與質(zhì)譜結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對66株C群Nm菌株及2株參考菌株的部分外膜蛋白和sucD蛋白表型進(jìn)行分析，根據(jù)外膜蛋白和sucD蛋白將實(shí)驗(yàn)菌株共分為9型，其中安徽菌株分型結(jié)果顯示出了高度的一致性，而其他地區(qū)菌株分型分布則顯示出高度的多態(tài)性，結(jié)果對認(rèn)識(shí)安徽省流腦的流行規(guī)律和有效進(jìn)行流腦疫情的防控具有重要意義。

綜上所述，Nm的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)涉及傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測技術(shù)、免疫學(xué)ELISA及不斷更新的分子生物學(xué)方法，如PCR、熒光定量PCR、多重PCR、LAMP技術(shù)、MLVA分型、MLST 技術(shù)、PFGE分型、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等。Nm的分子生物學(xué)方法比傳統(tǒng)病原學(xué)檢測法具有更高的特異性和靈敏度。當(dāng)然各種技術(shù)并非單一的，實(shí)際工作中可能相互融合，以更好地優(yōu)化Nm的檢測分析。新的方法也有其不足之處，如LAMP因靈敏度高，容易形成氣溶膠污染，由于國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能嚴(yán)格分區(qū)，假陽性問題可能比較嚴(yán)重，因此，引物設(shè)計(jì)要求比較高，有些疾病的基因可能不適合使用LAMP；蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中2-DE技術(shù)還不成熟，現(xiàn)在有更新的色譜質(zhì)譜聯(lián)用法取代2-DE和質(zhì)譜鑒定法，對蛋白質(zhì)的鑒定更準(zhǔn)確，將更好地服務(wù)于疾病預(yù)防控制工作中。