李 甜，覃 英，胡 渝（重慶市人民醫(yī)院400014）

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈全球分布趨勢，是世界性公共衛(wèi)生疾病之一，也是危害中國公共衛(wèi)生健康的疾病重要之一[1]。本研究中，通過對重慶市HBV病毒情況進行群體遺傳學分析，探討重慶地區(qū)HBV病毒的群體遺傳多樣性，進一步判斷重慶市HBV群體擴張趨勢，最終預測重慶地區(qū)HBV病毒爆發(fā)的風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇重慶市范圍內8個不同的區(qū)（黔江區(qū)、萬州區(qū)、南川區(qū)、涪陵區(qū)、北碚區(qū)、墊江縣、合川區(qū)和沙坪壩區(qū)），收集HBV感染患者的血清，患者入院時間為2014年1—12月，患者戶籍為重慶且長期居住在重慶，排除標準為患有其他類型肝炎。血清分離后使用干冰運輸，保存在?80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 使用E?CyclerTM 96聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（北京博奧生物有限公司）。由上海PerkinElmer提供磁珠法提取HBV DNA試劑盒。德國Qiagen公司提供PCR擴增試劑。華大基因提供PCR引物（10μmol/L），引物序列如下：5′?GCGGGGTTTTTCTTGTTGA?3′，5?GGGACTCAAGATGTTGTACAG?3′。

1.2.2 研究方法

1.2.2.1 標本處理及檢測 使用上海鉑金埃爾默生物科技有限公司試劑盒（磁珠法）進行提取。PCR擴增條件為：95℃ 預變性10 min；95℃變性30 s，52℃復性45 s，72℃延伸90 s，共40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產物由華大基因測序。

1.2.2.2 HBV 群體遺傳學分析 使用MEGA6.0軟件計算堿基組成、保守及變異堿基位點等[2]。使用DNAspv5.0軟件[3]計算單倍型多肽性（h）、單倍型數量（hap）和核苷酸多肽性（p）。使用軟件DNAspv5.0計算Fu's Fs值及Tajima's D值，并構建錯配分布。若HBV有效種群保持穩(wěn)定，則核酸的錯配分布曲線呈現出多峰曲線分布，同時Fu's Fs和Tajima D值檢驗不顯著。若群體經歷過擴張，則核酸的錯配分布曲線呈單峰倒鐘形分布[4]，Fu's Fs中性檢驗和Tajima D值同時偏離中性突變。使用軟件BEAST v1.7.1分析群體增長時間和擴張情況，分析各地區(qū)各基因型貝葉斯輪廓圖（BSP）。B和C基因型的平均進化速度分別定義為：（7.72±5.00）×10?4位點/年，（3.73±2.10）×10?4位點/年[5-6]。使用 10 000 000代蒙特卡羅（MCMC），對每1 000代進行抽樣，計算得到10 001棵系統發(fā)育樹。比較分析MCMC的log文件與系統發(fā)育樹。使用Tracer 1.5軟件分析群體的有效大小[采用95%最大后驗密度（HPD）]和擴張時間，并生成貝葉斯輪廓圖[7]。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件對數據進行分析，定量資料以表示，采用t檢驗計數資料以表示，采用χ2檢驗比較計數數據間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HBV系統發(fā)育結果 把HBVS基因所測序列與A-H型參考序列[8]（來自NCBI）進行比對，剔除比對不能滿足要求的前后各一段序列，最終B型堿基數量為531bp的序列長度用于系統發(fā)育分析。B型基因組成為A（19.2%）、T（31.8%）、C（27.9%）、G（21.1%）。C型堿基長度525 bp，組成為A（18.1%）、T（31.9%）、C（28.6%）、G（21.4%）。比對后B基因型的變異位點、保守位點、自裔位點和簡約信息位點分別為189、339、66、123個。C基因型包括變異位點、保守位點、自裔位點和簡約信息位點分別為189、339、66、123個。用本研究獲得的528個HBV S基因序列及A-H型的參考序列（從NCBI網站上獲得）構建得到系統發(fā)育樹。進化樹上各節(jié)點上的數值為自展分析值，發(fā)育可信時自展分析值大于90%。用Kimura 2-parameter模型計算并以堿基替換為單位來決定樹枝長短，以推斷樹的進化距離。本研究中所得的基因序列主要構建分為B、C和D基因型，3個基因型自展分析值均大于90%。

2.2 HBV群體遺傳學結果 B型的HBV序列共有346條，并含有250個單體型；C型HBV序列共有181條，包含163個單體型。各地區(qū)分布表1所示。各地區(qū)C型的核苷酸多態(tài)性（π）和單倍型多態(tài)性（h）均比B型的更高。（見表1）。

3 討 論

分子遺傳學是以核酸序列變異為基礎，以研究群體遺傳結構，以及群體遺傳結構與其影響因素的相互關系為研究目的。其主要衡量指標是基因同源序列的遺傳分化程度。群體遺傳結構主要影響因素包括基因重組、基因突變、基因轉換等。群體遺傳學研究一般是運用軟件分析群體基因及基因型頻率等數據，并構建相關模型[9]。

在中國，HBV主要為B和C型[10?12]。本課題組的前期研究證實墊江地區(qū)的HBV感染者B型和C型HBV有效種群大小在過去5年中經歷過一次較大的擴張，提示HBV在該地區(qū)爆發(fā)的風險非常大[13]；在另一項使用類似研究方法的研究表明，柳州地區(qū)HBV擴張速度較為緩慢[14]。本研究中，通過對HBV進行群體遺傳學分析，分析重慶地區(qū)HBV不同群體的遺傳多樣性，從而判斷重慶地區(qū)HBV群體擴張情況，最終判斷HBV爆發(fā)的風險。

本研究中樣本來自重慶8個地區(qū)中528個HBV感染血清中HBV S基因序列，并對群體遺傳多樣性及遺傳結構進行分析。結果顯示，346個B型S基因樣本中含有189個突變位點和250個單倍型（hap）。單倍型多態(tài)性（h）0.978，分布范圍0.895～0.999。核苷酸多態(tài)性（π）0.016 44，分布范圍0.026 28～0.006 94。181個C型S基因樣本中共150個突變位點、163個單倍型，h為0.999，分布范圍0.992～1.000；核苷酸多態(tài)性為0.020 51，分布范圍0.017 88～0.026 04。單倍型多態(tài)性和單倍型越高，表明群體遺傳多樣性豐富及種群越大，其生存能力也更強。本研究中HBV B型和C型單倍型多態(tài)性和單倍型均高，且C型高于B型，表明C型具有更強的生存能力。

為了分析HBV群體擴張的情況，作者使用了多種研究工具，包括Fu's Fs中性檢驗法、核苷酸錯配分布、BSP及Tajima's D中性檢驗法，從而多角度分析。Fu's Fs中性檢驗法主要反應的是種群的近期事件。若Fu's Fs值的負值增大，表明種群近期突變累積較多。種群的古老突變主要使用Tajima's D中性檢驗法顯示，Tajima's D值對種群事件反應較長。雖然HBV屬于DNA病毒，但逆轉錄酶校正功能缺乏，因而其比RNA病毒進化速度更快。有研究表明，HBV的進化速度為7.72×104位點/年[7]，高于人類T細胞白血病病毒[15]，高速進化的結果導致HBV感染宿主后高速擴張。BSP分析結果顯示，重慶地區(qū)HBV B型與C型10年中曾經發(fā)生過快速擴張，甚至某些地區(qū)擴張達到10倍。僅少部分地區(qū)（黔江區(qū)、合川區(qū)、沙坪壩區(qū)）的HBV C型擴張不明顯。HBV B與C基因型均呈典型倒鐘形分布，沙坪壩區(qū)、合川區(qū)及黔江區(qū)呈現多峰分布。加上Tajima's D值及Fu's Fs值結果均顯示為負值，且Fu's Fs值的趨勢遠遠大于Tajima's D值，提示HBV種群擴張主要發(fā)生在近期，與BSP分析結果一致。目前，重慶市區(qū)域內HBV種群擴張的原因仍然不明確。BSP圖分析顯示擴張時間發(fā)生在2008年后，因而推測2008年汶川大地震一個非?？赡艿脑?。例如，災民的遷移及地震治療不及時，均有可能導致HBV群體的擴張。本研究結果顯示，HBV群體有效種群大小呈現繼續(xù)擴張的趨勢，因此建議重慶地區(qū)對HBV感染控制方面采取更多、更有效的措施，并有必要組織大型的分子流行病學研究，并對HBV的爆發(fā)做好預警工作。