高玉龍，宋中邦，李梅云，李文正，王丙武，李永平

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家煙草基因工程研究中心，昆明650021)

植物NHX(Na+,K+/H+exchanger)是植物細(xì)胞重要的跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在建立和維持細(xì)胞內(nèi)離子及pH梯度中發(fā)揮重要的功能[1]。NHX反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要負(fù)責(zé)單價(jià)陽離子/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，有助于細(xì)胞內(nèi)Na+和K+的動(dòng)態(tài)平衡[2]。NHX蛋白將一價(jià)陽離子Na+或K+從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到液泡中，同時(shí)將H+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，這個(gè)過程還需要H+移位酶、H+-ATPase和H+-PPiase參與[3]。

NHXs普遍存在于所有真核生物中，在植物抵抗非生物和生物脅迫中起著重要作用，如提高耐鹽[4-5]、耐冷[6]、抗干旱[7]及抗病性[8]等能力。NHX耐鹽性研究最為廣泛，過表達(dá)擬南芥AtNHX1基因[5]、綠豆VrNHX1基因[9]、小麥TaNHX2基因[4]，均可提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。NHX基因過表達(dá)可以在液泡中分配更多的Na+被認(rèn)為是NHX蛋白增加植物耐鹽性的生理機(jī)制[10]。在番茄中過表達(dá)AtNHX1可以顯著提高番茄鉀離子含量及耐鹽性[11]，在落花生[12]、柳枝稷[13]、菊花[14]中也獲得同樣的結(jié)果。

煙草是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉品質(zhì)是決定煙葉價(jià)格的重要因素。鉀被認(rèn)為是煙草的品質(zhì)元素，鉀含量是評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。煙葉鉀含量提高可以改善煙葉的組織結(jié)構(gòu)，使煙葉結(jié)構(gòu)細(xì)膩，而且還能提高煙葉外觀色澤，使煙葉呈深橘黃色，香氣足，吃味好，富有彈性和韌性，填充性增強(qiáng)。鉀還可以增強(qiáng)煙葉糖類、色素類、芳香類物質(zhì)的合成積累。另外，中國(guó)土壤鹽漬化日益加重，培育耐鹽漬化煙草品種可以增加煙草種植面積。所以克隆煙草NHX1基因并研究其生理功能對(duì)煙葉生產(chǎn)意義重大。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本研究所用材料為‘云煙87’。開花期取根、莖、葉、花后液氮速凍并于-80 ℃保存，用于qRT-PCR分析NtNHX1-3的組織特異性表達(dá)情況。溫室種植‘云煙87’，按每株5 g純氮施入煙草專用復(fù)合肥(氮∶磷∶鉀=10∶10∶15)，分5次施入。打頂后0、8、24、48、72 和96 h取中部葉片(第9葉位)液氮速凍，于-80 ℃保存并用于qRT-PCR分析NtNHX1-3在打頂后的表達(dá)變化。對(duì)5～6片葉的‘云煙87’煙苗進(jìn)行鹽脅迫處理，在小花盆中每株施用100 mmol/L NaCl 500 mL，處理后0、1、3、6、12和24 h取葉片液氮速凍并保存于-80 ℃，用于qRT-PCR分析NtNHX1-3基因在鹽脅迫后的表達(dá)情況。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成按照試劑盒RNAiso Plus(Takara)的操作說明，提取各材料的總RNA。由微量紫外檢測(cè)儀Nano-Drop檢測(cè)RNA濃度。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time，TaKaRa)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2基因克隆擬南芥AtNHX1(NP_198067)蛋白提交NCBI煙草數(shù)據(jù)庫，利用Tblastn程序進(jìn)行搜索，獲得煙草NHX1基因同源序列。根據(jù)獲得的煙草同源序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)CDS序列引物F(ATGGCTTTCGACATTGGGATG)和R(TTAATGATCACTTGGTTCAGT)。以‘云煙87’葉片cDNA為模板克隆目的基因，反應(yīng)在Mastercycler?pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)總體積50 μL，包括200 ng cDNA，5×Phusion HF反應(yīng)緩沖液10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，2U的Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase，10 μmol/L正反向引物各1 μL，補(bǔ)水至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 30 s；98 ℃ 7 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分離后回收測(cè)序。

1.2.3生物信息學(xué)分析利用在線工具ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)分析推測(cè)的蛋白理論等電點(diǎn)、分子量等。wolf pSORT (http://www.genscript.com/wolf-psort.html)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析跨膜區(qū)。SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。ClustalX軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，然后用軟件MEGA6構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4qRT-PCR分析根據(jù)克隆的基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物PN3-QF(GGTCGGTCATTTGTTGGAGG)和PN3-QR(CGAGAGTTCTTCCCACCACT)。以煙草Actin基因作為內(nèi)參，引物為Actin-F(CTGAGGTCCTTTTCCAACCA)和Actin-R(TACCCGGGAACATGGTAGAG)。以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)在Roche LightCycler 480上利用LightCycler 480 SYBR Green I master進(jìn)行，20 μL體系含有 10 μL LightCycler 480 SYBR Green I master(2×)，正反引物各1 μL(10 μmol/L)，cDNA 1 μL(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋4倍)，7 μL 滅菌蒸餾水。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt方法計(jì)算NtNHX1-3基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，由Excel軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1NtNHX1-3基因克隆為了克隆煙草NHX1基因，將擬南芥AtNHX1(NP_198067)蛋白提交NCBI煙草測(cè)序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索，獲得2條煙草NHX1同源序列，其中一條NtNHX1-1本課題組已發(fā)表[15]，另一條命名為NtNHX1-3。依此序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)CDS引物(F: ATGGCTTTCGACATTGGGATG；R: TTAATGATCACTTGGTTCAGT)，通過PCR擴(kuò)增獲得1 617 bp的片段(圖1)。回收并測(cè)序，結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列100%一致，其編碼蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為538 aa。序列分析表明，NtNHX1-3編碼蛋白含有NHX類蛋白保守位點(diǎn)，即氨氯吡嗪咪結(jié)合位點(diǎn) (LFFIYLLPPI) (圖2)，該位點(diǎn)被認(rèn)為是結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的區(qū)域。多序列比對(duì)顯示， NtNHX1-3蛋白序列與擬南芥NtNHX1相似性為85%(圖2)。

M. DL2000圖1 NtNHX1-3 的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of NtNHX1-3

圖3 NtNHX1-3蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.3 Transmembrane region prediction of NtNHX1-3

2.2 生物信息學(xué)分析

利用在線工具ExPASy預(yù)測(cè)NtNHX1-3蛋白的理論等電點(diǎn)為8.67，分子量為59.34 kD。wolf pSORT預(yù)測(cè)NtNHX1-3屬于膜蛋白，TMpred分析NtNHX1-3具有11個(gè)跨膜區(qū)(圖3)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)NtNHX1-3 含有45.54%的α螺旋，19.33%的β折疊，29.18%的無規(guī)則卷曲，5.95%的β轉(zhuǎn)角。

NtNHX1-3與擬南芥、棉花、鷹嘴豆、番茄、小麥、菊苣、野菊花等NHX蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4)，煙草NtNHX1-3與菊苣、野菊花NHX遺傳距離最近，而與同是茄科的番茄NHX遺傳距離較遠(yuǎn)，可見NtNHX1-3在物種間變異較大，進(jìn)化速度較快。

2.3 NtNHX1-3 基因組織表達(dá)特性分析

qRT-PCR對(duì)NtNHX1-3基因在煙草開花期根、莖、葉、花中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明(圖5)，該基因在葉片中表達(dá)量最高，根、莖、花中也有表達(dá)。表明該基因組織特異性特點(diǎn)不明顯，可能在各個(gè)組織中都發(fā)揮功能。

圖4 NtNHX1-3蛋白與其他物種NHX1 蛋白序列的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of NtNHX1-3 and NHX1 from other plants

圖5 NtNHX1-3組織特異性表達(dá)分析Fig.5 Tissue-specific expression analysis of NtNHX1-3

方框所示為氨氯吡嗪咪結(jié)合位點(diǎn)圖2 煙草NtNHX1-3蛋白序列與擬南芥AtNHX1多序列比對(duì) Box indicated amiloride binding-siteFig.2 Sequence alignment of the deduced amino acid of NtNHX1-3 and AtNHX1

2.4 NtNHX1-3基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)分析

文獻(xiàn)報(bào)道NHX1基因在植物耐鹽脅迫中起著重要作用。為了初步研究NtNHX1-3基因是否在鹽脅迫中發(fā)揮功能，利用100 mmol/L NaCl處理煙苗，處理后不同時(shí)間點(diǎn)取樣分析NtNHX1-3基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明(圖6)，NaCl處理后3 hNtNHX1-3基因的表達(dá)開始提高，6 h達(dá)到最高峰，12 h和24 h下降到處理前水平。推測(cè)NtNHX1-3基因在煙草抵御鹽脅迫的初期發(fā)揮功能。

2.5 打頂后NtNHX1-3基因表達(dá)特性

打頂后煙草葉片鉀含量總體呈下降趨勢(shì)[16]，但也有研究報(bào)道鉀含量呈先上升后下降的趨勢(shì)[17]。作者研究表明烤煙推廣品種‘云煙87’及‘K326’葉片鉀含量在打頂后先上升，到20 d左右達(dá)最高值，然后急劇下降到低于打頂前的水平。該研究對(duì)打頂后0～96 h內(nèi)NtNHX1-3基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，該基因的表達(dá)在打頂后呈逐漸上調(diào)的趨勢(shì)(圖7)。該基因負(fù)責(zé)鉀離子從細(xì)胞質(zhì)向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，打頂初期NtNHX1-3基因表達(dá)上調(diào)，增加了鉀離子向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存，從而使葉片鉀離子含量升高。

圖6 NtNHX1-3鹽脅迫處理后的表達(dá)分析Fig.6 Expression of NtNHX1-3 after treatment by NaCl

圖7 NtNHX1-3打頂后表達(dá)分析Fig.7 Expression of NtNHX1-3 after topping

3 討 論

植物NHXs屬于單價(jià)陽離子/H+轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，而且普遍存在于所有真核生物中。在擬南芥基因組中鑒定了8個(gè)NHX蛋白，根據(jù)亞細(xì)胞分布分為3類：AtNHX1-4為液泡NHX，NHX5-6為內(nèi)膜NHX，NHX7-8為質(zhì)膜NHX[2,18-20]。NHX1屬于液泡膜Na+,K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，定位于液泡膜，主要負(fù)責(zé)將Na+和K+從細(xì)胞質(zhì)泵入液泡，同時(shí)將H+從液泡泵入細(xì)胞質(zhì)以維持離子電荷平衡[11,21]。

NHX1在植物抵抗鹽脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。NHX1的耐鹽性首先是在過表達(dá)擬南芥AtNHX1后發(fā)現(xiàn)的，過表達(dá)AtNHX1植株細(xì)胞內(nèi)過多的Na+可以被轉(zhuǎn)移到液泡內(nèi)，從而使細(xì)胞質(zhì)Na+可以維持在一個(gè)適宜的含量水平。隨后過表達(dá)NHX1的相關(guān)研究[22-24]及耐鹽植物品種中NHX1基因的表達(dá)分析[25-26]證實(shí)了NHX1轉(zhuǎn)運(yùn)體在耐鹽中的重要功能。除了增強(qiáng)耐鹽性，NHX1在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中維持K+平衡方面也發(fā)揮重要功能。由于K+是許多酶的輔助因子，所以NHX1對(duì)植物的正常發(fā)育是必須的。擬南芥nhx1突變體細(xì)胞變小、植株變矮，nhx2突變體沒有明顯的表型變化，但是雙突變植株nhx1nhx2細(xì)胞延伸、生長(zhǎng)抑制效果相比nhx1更為顯著，表明NHX1和NHX2間存在功能冗余和互補(bǔ)。雙突變植株nhx1nhx2由于液泡鉀離子含量減少，其葉片鉀離子只有野生型的1/3[27]。

本課題組先前已報(bào)道了1個(gè)煙草NtNHX1-1基因[15]，NtNHX1-1受NaCl處理誘導(dǎo)表達(dá)，表明NtNHX1-1在煙草耐鹽方面發(fā)揮一定功能。本研究克隆了煙草的另1個(gè)NHX1基因NtNHX1-3。NaCl處理后早期NtNHX1-1的表達(dá)上升，推測(cè)其也參與了煙草的耐鹽脅迫。另外，在煙草打頂初期該基因的表達(dá)逐漸上升，而煙草鉀含量在這個(gè)時(shí)期也呈上升趨勢(shì)，可能是由于NtNHX1-3基因表達(dá)提高后增加了液泡鉀離子含量，從而提高了細(xì)胞及葉片的鉀含量。后續(xù)將對(duì)煙草NtNHX1-3基因在耐鹽性及提高鉀含量方面的功能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定。