劉東讓，侯喜林，張昌偉，肖 棟,*

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室，北京 100081；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實驗室，南京 210095；3 江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心，南京 210095)

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一種富含半胱氨酸短肽的低分子量蛋白，普遍大小為5～10×103Da[1]。1957年，金屬硫蛋白在馬腎皮質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，植物MT最早是于1977年從大豆根中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MT廣泛分布于動物、植物、真菌及細(xì)菌等幾乎所有生物體內(nèi)[2-6]。Fowler等[7]根據(jù)MT中Cys殘基的排列方式，將所有生物的MT分為3類(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類)。

植物中，根據(jù)半胱氨酸殘基數(shù)目和排列的不同可將MT歸為Ⅱ類[8-9]。根據(jù)Cobbett等[10]的分類，可將植物Ⅱ類MT進(jìn)一步分為4種類型：MT1(p1)、MT2(p2)、MT3(p3)與MT4(pec/Ec蛋白)。已有研究表明，植物MT2包含2個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，每個域包含1個高度保守的MSCCGGNCGCG結(jié)構(gòu)以及3個Cys-Xaa-Cys模塊，被大約40個的氨基酸殘基連接，多分布在地上部分[11]。據(jù)報道，MT與植物的生長發(fā)育、胚發(fā)育、果實成熟、衰老、抗逆反應(yīng)以及基因調(diào)控等過程有關(guān)[12]。目前多數(shù)研究認(rèn)為，MT的主要功能是與生物體內(nèi)的金屬離子相結(jié)合，從而起到運(yùn)輸、儲存金屬離子、維持細(xì)胞內(nèi)的氧化-還原平衡等作用，而且生物體內(nèi)的MT大多需經(jīng)過金屬離子、細(xì)胞分裂素、鹽、干旱等脅迫誘導(dǎo)才會表達(dá)[13]。植物激素脫落酸(ABA)作為重要的內(nèi)源信號物質(zhì)，在誘導(dǎo)植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[14]。因此，克隆MT基因并分析該基因的表達(dá)特征，對探討不結(jié)球白菜對逆境的響應(yīng)機(jī)理及抗逆分子育種具有重要價值。人們已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)、芹菜(ApiumgraveolensL.)、平邑甜茶(Malushupehensis)等植物中克隆了編碼MT蛋白的基因或cDNA 序列[1,12,15-17]。但與對動物MT的研究相比，對植物MT的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足[18]。近年來，對植物MT基因在組織器官特異性、表達(dá)特征和基因組結(jié)構(gòu)等方面的研究得到一定發(fā)展[4]。盡管已從植物中克隆到許多編碼MT的基因，但對不結(jié)球白菜MT基因的研究報道很少。

不結(jié)球白菜(Brassicacampestris ssp.chinensis)是中國重要的綠葉蔬菜，由于世界范圍內(nèi)的廣泛引種，不結(jié)球白菜逐漸成為世界性蔬菜[19]。各類病害、外源ABA、鹽、干旱等生物和非生物脅迫常影響不結(jié)球白菜生長發(fā)育，導(dǎo)致其產(chǎn)量下降，品質(zhì)降低[14,20]。因此，本研究以cDNA-AFLP方法從不結(jié)球白菜中獲得的受霜霉病菌誘導(dǎo)的差異表達(dá)片段為基礎(chǔ)[21]，利用RACE技術(shù)從不結(jié)球白菜抗病系‘蘇州青’中克隆了BcMT2基因，并進(jìn)行了氨基酸序列分析。同時通過qRT-PCR技術(shù)分析BcMT2基因在不同組織、生物脅迫(霜霉病菌)及非生物脅迫(鹽、干旱、ABA)處理條件下的表達(dá)模式，并通過原核表達(dá)對該基因的蛋白特征進(jìn)行鑒定。旨在深入研究MT基因在不結(jié)球白菜上的表達(dá)模式，進(jìn)而為選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新品種提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試材料為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜課題組提供的不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病品種‘蘇州青’和感病品種‘矮腳黃’。所有的種子先在1.0 g·L-1HgCl2里消毒20 min，再用蒸餾水沖洗10次。后將2個品種的種子分別播種于2個72孔穴盤的滅菌基質(zhì)中，后放置于人工氣候箱中培養(yǎng)，每日22 ℃光照培養(yǎng)16 h，16 ℃暗培養(yǎng)8 h，相對濕度(85%±5%)。待催芽28 d(5～6片真葉)后，分別從2個品種中選出63株長勢良好的植株用于誘導(dǎo)處理。

1.2 實驗方法

1.2.1生物、非生物脅迫處理及取樣從感病的不結(jié)球白菜上分離霜霉病菌(P.parasitica)，配成1×105mL-1孢子囊懸浮液，霜霉病病原菌接種液的制備參照陳曉峰[22]的方法。播種28 d后，分別用霜霉病接菌液、200 g·L-1PEG6000、400 mmol·L-1NaCl、50 μmol·L-1ABA及純水對選出的植株進(jìn)行處理，取樣時間點(diǎn)有5個，每個時間點(diǎn)3個重復(fù)，即每個品種每個脅迫處理15株植株，純水處理需3個重復(fù)，總計每個品種需63株樣本。處理后在人工氣候箱20 ℃黑暗中保濕24 h，然后揭掉遮光物，再在22 ℃光照培養(yǎng)16 h，16 ℃暗培養(yǎng)8 h，相對濕度(85%±5%)條件下培養(yǎng)，直至采樣結(jié)束。組織特異性表達(dá)分析使用的材料分別取自2份未經(jīng)脅迫處理的不結(jié)球白菜植株苗期(播種后28 d)的根、莖、葉。脅迫處理表達(dá)分析，分別在處理后12、24、48、72和96 h進(jìn)行取樣。上述材料取樣后立即在液氮中冰凍，使用前保存在-70 ℃冰箱中。

1.2.2RNA提取和cDNA合成使用RNA Simple Total RNA Kit試劑盒(TaKaRa)提取樣品總RNA，具體方法參照說明書。用核酸儀對提取的總RNA濃度和純度進(jìn)行檢測。cDNA使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成，作為基因克隆所需的模板。

1.2.3BcMT2全長cDNA克隆以霜霉病菌誘導(dǎo)后24 h的不結(jié)球白菜‘蘇州青’葉片為試材，使用3′/5′RACE System 試劑盒(Invitrogen)克隆基因全長cDNA序列。具體操作過程參考陳曉峰[22]的方法?？寺cMT2基因的引物見表1，引物設(shè)計用在線軟件Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，引物由南京擎科公司合成。

1.2.4序列分析用Bioxm 2.7軟件分析BcMT2基因序列的開放閱讀框(open reading frame, ORF)。

表1 本研究用到的各種引物信息

注：F.正向引物；R.反向引物；UP.上游引物；Down.下游引物；下劃線為SacⅠ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)序列；酶切位點(diǎn)之前堿基為保護(hù)堿基。

Note: F. Forward; R. Reverse; UP. Upstream primer; Down. Downstream primer; Underlined. Sequence ofSacⅠ andBamHⅠ. The front of the restriction site is protective bases

不同物種BcMT2基因的氨基酸序列從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中搜索獲得；同源性計算利用 NCBI網(wǎng)站Blast程序；氨基酸編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)等通過在線軟件Protparam(https://web. expasy.org/Protparam/)完成；疏水性預(yù)測采用protscale(https: //web. expasy.org/protscale/)；信號肽預(yù)測采用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜區(qū)域預(yù)測采用TMHMM 2.0(http:// www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用NCBI-Conserved Domain SearchInterpro；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/ NPSA/npsa_phd/)等在線工具；多重序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建通過DNAMAN 5.2進(jìn)行[23]。

1.2.5實時定量分析BcMT2轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平cDNA合成使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)說明書完成。實時定量PCR使用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ試劑盒(TaKaRa, Japan)完成，PCR反應(yīng)體系采用20 μL體系：MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，rTaq酶0.2 μL，引物BcSGT1_RT_F和BcSGT1_RT_R各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR程序采用兩步法：95 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；設(shè)置60 ℃到95 ℃的熔解曲線。3次重復(fù)，用純水作為對照。試驗數(shù)據(jù)采用ΔΔCT方法[24]和Excel 2010軟件進(jìn)行分析，差異顯著性分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行。

1.2.6原核表達(dá)將克隆的BcMT2基因連接至pMD19-T載體，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pMD19-T-BcMT2。用SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切及菌液PCR鑒定后，含陽性重組質(zhì)粒的菌液送交南京擎科公司測序。把上述測序正確的重組質(zhì)粒作為模板，以上游引物BcMT2_Up和下游引物BcMT2_Down擴(kuò)增BcMT2基因編碼區(qū)(表1)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收后用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a-BcMT2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。挑取陽性菌落接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含200 μg·mL-1氨芐青霉素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，以此作為種子液。取種子液用終濃度為0.6和1.0 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)EscherichiacoliBL21 (DE3) 表達(dá)融合蛋白，設(shè)置取樣時間分別為2、4、6 h。取菌液3 mL，12 000 r·min-1離心30 s，棄上清液，用100 μL的1×SDS-PAGE加樣緩沖液重懸菌體，將上清液參照Tashakkori等[25]的方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BcMT5基因cDNA全長克隆以及序列分析

以cDNA-AFLP方法從不結(jié)球白菜中獲得的霜霉病菌誘導(dǎo)的差異表達(dá)片段(397 bp)為基礎(chǔ)，采用RACE技術(shù)獲得其全長，命名為BcMT2(登錄號為AB439836)。該基因cDNA序列全長為528 bp，含有243 bp的完整開放閱讀框，編碼80個氨基酸(圖1)。預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)化學(xué)式為C319H497N91O117S17，分子質(zhì)量為8.02×103Da，理論等電點(diǎn)為4.61。屬于酸性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)為43.29，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為22.00。ProtScale親/疏水性預(yù)測顯示：該蛋白屬于親水性蛋白，總平均親水指數(shù)(GRAVY)為-0.245；該蛋白無信號肽，并且不存在跨膜區(qū)域；該蛋白在第23～239個氨基酸處有一個Metallothio-2結(jié)構(gòu)域。屬于植物MT2家族，又與擬南芥中的多種金屬硫蛋白序列進(jìn)行比對，BcMT2也屬于植物MT2(圖2)。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示:其為延伸鏈和無規(guī)則卷曲，分別占17.5%和82.5%。該基因在起始密碼子ATG之前有A，符合Kozak規(guī)律；在3′端有poly(A)尾，這些都符合有效翻譯的基因全長cDNA的特征。

方框表示起始密碼子，下劃線表示Metallothio-2 結(jié)構(gòu)域，*表示終止密碼子圖1 BcMT2核苷酸序列(上)及其 翻譯的氨基酸序列(下) Square frame indicates the translation initiation codon, underline indicates the amino acid sequence of the Metallothio-2, an asterisk (*) indicates the stop codonFig.1 The nucleotide (upper row) and amino acid sequence (lower row) of BcMT2

2.2 BcMT2蛋白氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將BcMT2編碼的氨基酸序列及從NCBI中BLAST獲取的其他植物MT2氨基酸序列(編碼區(qū))進(jìn)行系統(tǒng)樹分析。結(jié)果(圖3)顯示，不結(jié)球白菜BcMT2與大白菜第5號染色體的基因(Bra029765)的相似性為100%；與蘿卜、擬南芥和甘藍(lán)相似性分別為97%、96%和95%；與高山南芥和甘藍(lán)型油菜相似性在85%以上。表明同科植物的氨基酸序列相似度較高。由此發(fā)現(xiàn)十字花科植物的BcMT2蛋白與同屬植物的進(jìn)化關(guān)系最近，呈現(xiàn)種屬特性。

2.3 BcMT2基因的組織特異性表達(dá)分析

結(jié)果(圖4)表明，BcMT2基因在兩份材料的葉中表達(dá)最強(qiáng)，且表達(dá)量遠(yuǎn)高于根和莖。另外，BcMT2基因在兩份材料莖中的表達(dá)量存在顯著差異(P< 0.05)，且在‘蘇州青’莖中的表達(dá)量約為在‘矮腳黃’中的5.93倍，而在根和葉中表達(dá)量差異不顯著。

圖2 BcMT2和擬南芥中金屬硫蛋白 氨基酸序列的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of BcMT2 and metallothioneins of Arabidopsis thaliana

圖3 不同植物BcMT2蛋白的系統(tǒng)樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of BcMT2 proteins from different plants

2.4 生物及非生物脅迫下BcMT2的表達(dá)分析

由圖5可見，霜霉病菌侵染處理下，BcMT2基因在抗病品種‘蘇州青’中的表達(dá)量于48 h達(dá)到峰值(為對照的6.01倍)，而在感病品種‘矮腳黃’中的表達(dá)量于72 h達(dá)到峰值(為對照的5.6倍)；在鹽處理下，BcMT2基因在抗病品種‘蘇州青’中的表達(dá)量于12 h達(dá)到峰值(為對照的2.51倍)，而在感病品種‘矮腳黃’中的表達(dá)量于24 h達(dá)到峰值(為對照的2.22倍)；在ABA處理下，‘蘇州青’中其表達(dá)量于24 h達(dá)到峰值(為對照的17.25倍)，且在‘矮腳黃’中BcMT2基因的表達(dá)趨勢與‘蘇州青’類似；而在2個材料中，干旱處理均抑制了BcMT2基因的表達(dá)。t測驗表明在4個處理過程中，在部分時間點(diǎn)上抗病系‘蘇州青’與感病系‘矮腳黃’之間表達(dá)量存在顯著差異。表明BcMT2基因在不結(jié)球白菜受生物和非生物脅迫的干擾后參與了防衛(wèi)反應(yīng)，而且在抗病系植株上比感病系植株上表達(dá)更早、表達(dá)量更強(qiáng)。

2.5 BcMT2基因的原核表達(dá)分析

對BcMT2進(jìn)行原核表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在37 ℃條件下，0.6 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)2、4、6 h后，均沒有融合蛋白表達(dá)。而1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)2、4、6 h后，在底部出現(xiàn)明顯的表達(dá)特異條帶(圖6)。BcMT2在E.coliBL21(DE3)中獲得了表達(dá)，表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量約為8×103Da。

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著性圖4 不同不結(jié)球白菜BcMT2基因的組織 特異性表達(dá)分析 Different normal letters mean significant differeace at 0.05 levelFig.4 Tissue specificity expression profiles of BcMT2 gene in different non-heading cabbages

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著性；不同大寫字母表示0.01水平差異顯著性圖5 ‘蘇州青’和‘矮腳黃’脅迫誘導(dǎo)后BcMT2基因的表達(dá) Different normal letters mean significant difference at 0.05 level; different capital letters mean significant difference at 0.01 levelFig.5 Expression of BcMT2 in ‘Suzhouqing’and ‘Aijiaohuang’under stress

M. Marker圖6 BcMT2基因原核表達(dá)SDS-PAGE電泳Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of the prokaryotic expression of BcMT2 gene

3 討 論

據(jù)報道，植物MT基因家族成員的多肽長度為45～87個氨基酸殘基，Cys殘基含量在10～17個，而His殘基含量很低[4]。本研究在通過cDNA-AFLP技術(shù)得到的一個差異表達(dá)片段基礎(chǔ)上，利用RACE技術(shù)克隆了BcMT2基因的全長序列。通過核苷酸和氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)BcMT2基因編碼80個氨基酸，其中含有14個Cys殘基，占總氨基酸數(shù)的17.5%。這與王順才等[16]在平邑甜茶中的研究結(jié)果一致。植物MT2多肽N端通常具有高度的保守序列MSCCGGNCGCGS，Cys殘基有典型的CC、CXC和CXXC排列方式，而且C端包含3個按CXC方式排列的Cys基序[10]。本研究發(fā)現(xiàn)BcMT2基因編碼蛋白含有與之相同的保守序列MSCCGGNCGCGS，同時N端包含1個CC、1個CXXC及2個CXC基序，在C端也有3個CXC基序。這與水稻、平邑甜茶、芹菜等植物的研究結(jié)果相一致[1,16,26]。進(jìn)一步，將BcMT2基因氨基酸序列與擬南芥MT氨基酸序列進(jìn)行比對，構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)與擬南芥MT2的進(jìn)化關(guān)系最近。此外，多重序列比對分析表明，BcMT2基因氨基酸序列與同科的大白菜、蘿卜、擬南芥等植物具有很高的同源性，其中與大白菜第5號染色體的基因(Bra029765)一致性最高(100%)。綜合這些結(jié)果，不結(jié)球白菜BcMT2基因?qū)儆冖蝾愔参颩T2基因家族。

目前普遍認(rèn)為，植物MT基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。已有研究發(fā)現(xiàn)，MT2在地上部的表達(dá)明顯高于根[1]。擬南芥AtMT1在根中表達(dá)豐富，在葉中的表達(dá)量低；AtMT2在葉中的表達(dá)量比根中的高；AtMT3主要在果實和葉中表達(dá)；AtMT4主要在種子中表達(dá)[4,18,27]。本研究也發(fā)現(xiàn)，BcMT2基因在不結(jié)球白菜地上部(莖、葉)中的表達(dá)量明顯高于根，且葉中的表達(dá)量明顯高于其他部位，這與齊世靜等[28]的研究結(jié)果一致。

適宜的環(huán)境有利于白菜的生長發(fā)育，而異常的環(huán)境則會抑制白菜的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡。霜霉病、干旱、鹽及外源激素等外界生物和非生物脅迫會嚴(yán)重影響白菜的品質(zhì)和產(chǎn)量。為了適應(yīng)這些逆境，植物進(jìn)化出了一套復(fù)雜的抵御系統(tǒng)[9]。金屬硫蛋白基因在金屬解毒方面可以發(fā)揮很大的作用[1,18]。目前在MT基因表達(dá)影響因素方面，金屬離子研究已有很多。除此之外，MT基因表達(dá)還受環(huán)境脅迫、激素、病菌侵染等因素的調(diào)節(jié)[4,21,29]。Xiao等[21]通過cDNA-AFLP發(fā)現(xiàn)MT2基因在霜霉菌誘導(dǎo)下于48 h后表達(dá)量達(dá)到峰值。這與本實驗BcMT2在‘蘇州青’中的表達(dá)趨勢一致，同時發(fā)現(xiàn)不論在抗病系‘蘇州青’還是感病系‘矮腳黃’上BcMT2均受到霜霉病菌的誘導(dǎo)，且在抗病系比在感病系表達(dá)量更早、更強(qiáng)。說明BcMT2的誘導(dǎo)與基因型的抗病或感病能力有一定的聯(lián)系。已有多項研究在不同植物上表明，鹽和外源ABA處理會誘導(dǎo)MT基因的表達(dá)[1,16,27,29]。這與本研究結(jié)果一致，且發(fā)現(xiàn)BcMT2基因在不結(jié)球白菜抗病系‘蘇州青’和感病系‘矮腳黃’上的表達(dá)量出現(xiàn)了不同時間的誘導(dǎo)高峰。表明BcMT2涉及的防衛(wèi)反應(yīng)可能是在不同時間段，通過產(chǎn)生不同的信號途徑對外源脅迫發(fā)揮作用。另有研究顯示，干旱脅迫下MT基因的表達(dá)大幅度上升[30]。而陳逸云[1]則在芹菜品種‘六合黃心芹’中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會抑制MT2基因的表達(dá)。本研究結(jié)果與陳逸云[1]類似，在干旱脅迫下，BcMT2基因在2個不結(jié)球白菜品種中的表達(dá)均受到了抑制。

BcMT2原核表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，分別在37 ℃、1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)2、4、6 h后，檢測到了一條蛋白分子質(zhì)量約為8×103Da的表達(dá)特異條帶，其與預(yù)期融合蛋白的相對分子質(zhì)量的理論值8.02×103Da相符。而含有轉(zhuǎn)化子但未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體在該蛋白條帶處未出現(xiàn)此條帶，因此可以基本確定這一蛋白條帶為表達(dá)的融合蛋白。

綜上所述，不結(jié)球白菜BcMT2基因?qū)儆冖蝾愔参颩T2基因家族，受霜霉病菌、鹽、外源激素ABA等外界生物和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，表明不結(jié)球白菜BcMT2基因在處于生物脅迫和非生物脅迫等逆境環(huán)境中均發(fā)揮著重要作用，且BcMT2在大腸桿菌中成功實現(xiàn)融合表達(dá)，這為下一步蛋白水平研究和轉(zhuǎn)基因功能研究提供了條件，也將為選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的不結(jié)球白菜新品種提供重要的理論依據(jù)。