魏 明，余茂元，柴瑞娟

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院， 安徽蕪湖 241000)

光合作用是植物生長發(fā)育的重要生理過程，通過研究植物葉片光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，可以了解植物光合作用與環(huán)境因子之間的關(guān)系[1]。石斛屬植物具有景天酸代謝(CAM)途徑的特征，其CAM途徑的表達(dá)與環(huán)境變化有關(guān)[2-4]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是CAM植物光合碳代謝的源頭關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)量的高低對PEPC活性具有重要影響[5]。pepc基因是決定CAM植物光合碳同化速率的關(guān)鍵基因，通過研究pepc基因的表達(dá)，可以進一步明確環(huán)境因素對CAM植物光合碳同化的影響。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬植物，是珍稀藥用植物[6]。鐵皮石斛生長緩慢，其原因與該物種的生態(tài)環(huán)境特征有關(guān)，也與根際微生物的形成有關(guān)。菌根技術(shù)是一種先進的真菌肥料技術(shù)，通過菌根技術(shù)能提高植物根系吸收水分和營養(yǎng)成分的能力，增強植株的抗逆性，有效提高植株的光合作用，促進植物生長[7-10]。在自然界中，絕大多數(shù)石斛在生長過程中都能與相應(yīng)的真菌形成共生關(guān)系，彼此互惠互利。研究表明，石斛幼苗接種菌根真菌后，有助于提高石斛幼苗的生理活性[11]，提高其成活率，促進石斛幼苗的生長[12]，對鐵皮石斛的引種馴化具有重要作用。有關(guān)菌根真菌對鐵皮石斛光合性能以及pepc基因表達(dá)的影響還鮮有報道。本試驗通過接種蘭科菌根真菌，探討菌根真菌對鐵皮石斛光合性能以及pepc基因表達(dá)的影響，以期從光合作用角度闡明菌根真菌促進石斛生長的機制，為石斛的菌根化栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

鐵皮石斛無菌苗由安徽工程大學(xué)組培基地提供，菌根真菌為本實驗室從野生金釵石斛中分離的絲核菌，編號為(OM12)，初步鑒定為角菌根菌屬(Ceratorhiza)，由本實驗室保存；栽培培養(yǎng)基為粉碎的樹皮，營養(yǎng)成分為發(fā)酵過的豆餅。

1.2 接種菌劑的制備和試驗設(shè)計

將菌根真菌接種在馬鈴薯和葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 d，得到液體菌劑備用。試驗設(shè)計分為接種蘭科菌根真菌(OM真菌，+M)和不接種OM真菌作為對照(-M)2種處理，每個處理重復(fù)3次。選生長一致的鐵皮石斛無菌苗(苗高4 cm左右)為原始試驗材料，以盆栽的方式進行培養(yǎng)。栽種之前，盆利用0.1% HgCl2消毒10 min，培養(yǎng)基在121 ℃下濕熱滅菌30 min，其中培養(yǎng)基含有發(fā)酵過的豆餅，樹皮和豆餅的比例為7∶3。幼苗移栽后開始接種菌根真菌，每隔6 d接種1次，每次接種菌劑10 mL，連續(xù)接種3次，培養(yǎng)溫度為(25±0.5) ℃, 相對濕度為80%，光照強度為300 μmol·m-2·s-1。試驗在安徽工程大學(xué)溫室中進行，培養(yǎng)時間2017年4～9月。

1.3 生長指標(biāo)和葉綠素含量測定

參考Biermann和Linderman[13]描述的方法鑒定菌根的形成情況。取1 cm左右的根段，漂洗，酸化，染色，脫色等過程，根段有顏色即表示菌根形成。隨機選擇處理幼苗5株，洗凈后去除表面水分，測量每株的株高，分別稱取根部和地上部分的質(zhì)量(以鮮重表示)，3次重復(fù)取平均值。葉綠素含量采用丙酮酸/乙醇混合液法提取測定[14]。

1.4 光合作用參數(shù)和響應(yīng)曲線的測定

使用Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)(Licok公司 美國)測定光合作用指標(biāo)。測定時的葉室配備LED紅藍(lán)光源，葉室光量子通量為300 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·m-2·s-1。選擇長勢一致的葉片(上午9:00～11:00取葉片)，每個處理測定3株，每株取5片葉片，每片葉取5個瞬時凈光合速率(Pn)，儀器同時記錄氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)等參數(shù)值。利用Li-6400的曲線測定功能，將紅藍(lán)光源設(shè)定一系列光合有效輻射強度(PAR)0、50、100、200、400、600、800、1 000 μmol·m-2·s-1，在CO2濃度為400 μmol·m-2·s-1時，測定葉片Pn，繪制Pn-PAR的響應(yīng)曲線，測定時葉片溫度設(shè)為25 ℃。再利用Li-6400的曲線測定功能，將CO2濃度設(shè)為0、50、100、200、400、600、800 μmol·m-2·s-1，在光量子通量為300 μmol·m-2·s-1時，測定葉片Pn，繪制Pn-CO2的響應(yīng)曲線。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

采用Mini-PAM型便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(WALZ公司 德國)測定葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)。測定時選擇長勢一致的葉片，每個處理測定3株，每株取5片葉片。每次測定前葉片均經(jīng)過暗適應(yīng)30 min，測定初始熒光(F0)、最大熒光(Fm)，計算可變熒光Fv(Fv=Fm-F0)，最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)，潛在光化學(xué)效率(Fv/F0)。打開內(nèi)源光化光(300 μmol·m-2·s-1)，至穩(wěn)態(tài)后照射遠(yuǎn)紅外光，測定PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子效率(Yield)、表觀光合電子傳遞速率(ETR)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)。

1.6 引物設(shè)計、RNA提取和cDNA合成

利用已知的鐵皮石斛pepc基因序列設(shè)計定量PCR引物(NCBI檢索登錄號為JF423930)[15]，引物由上海生物工程公司合成，內(nèi)參基因為鐵皮石斛β-actin[16]，引物序列見表1。利用RNA提取試劑盒(上海生物工程公司)分別提取鐵皮石斛不同生長時期的葉片總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于基因的特異性表達(dá)分析，方法參照試劑盒說明書。

1.7 mRNA的RT-PCR擴增

利用SYBR Green試劑盒(Takara公司 中國)進行實時熒光定量PCR分析，在480Ⅱ熒光定量PCR儀(Roche公司 瑞士)上進行試驗。反應(yīng)體系 (共20 μL)：10 μL SYBR Primix Ex TaqTM，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL，用ddH2O補足至20 μL；RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40循環(huán)，在65 ℃延伸步驟收集熒光信號后，采用2-ΔΔCT進行相對定量分析。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，BOX Chemi XR凝膠成像儀(Syngene 英國)拍照分析。

1.8 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性測定

根據(jù)PEPC催化原理，在Mg2+存在下，PEPC把磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-催化形成草酰乙酸。草酰乙酸和NADH在蘋果酸脫氫酶的作用下形成蘋果酸和NAD+。通過測定340 nm下NADH的氧化速率可計算出PEPC活性大小。分別取不同生長時期的鐵皮石斛葉片0.1 g，用Tris-HCl緩沖液和葉片混合于冰浴中研磨，在4 ℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。反應(yīng)體系：1 mL 100 mmol·L-1Tris-HCl，內(nèi)含100 mmol·L-1MgCl2，pH 9.2，0.1 mL 40 mmol·L-1PEP，0.1 mL 5 mmol·L-1NADH，過量的蘋果酸脫氫酶，0.1 mL酶液，0.1 mL 100 mmol·L-1NaHCO3啟動液，1.5 mL蒸餾水，反應(yīng)液總體積為3 mL，在25 ℃下保溫10 min，在340 nm處測定吸光值，每隔10 s測定吸光值，記錄吸光值的變化。酶活力定義為：在測定條件下，每分鐘內(nèi)每毫升酶液氧化1 μmol NADH為一個酶活單位(μmol·mL-1·min-1)。

表1 RT-PCR引物信息

1.9 試驗數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同處理組間的差異，顯著性水平設(shè)定在α=0.05，采用Origin 8.6軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OM真菌對鐵皮石斛生長的影響

OM真菌對鐵皮石斛生長具有顯著的促進作用，鐵皮石斛組培苗接種OM真菌后生長比對照組旺盛，苗色濃綠，產(chǎn)生新根多。由表2可知，接種OM真菌后，株高、根重、莖葉重和總生物量均顯著高于對照組(P<0.05)，其中株高、根重、莖葉重和總生物量分別是未接種對照組的1.21、1.54、1.71和1.68倍。

2.2 OM真菌對鐵皮石斛葉片葉綠素含量的影響

光合色素是植物進行光合作用所必需的物質(zhì)，其含量高低在一定程度上反映了植物葉片光合作用的強弱。從表3可以看出，OM真菌對鐵皮石斛葉片中葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量影響顯著(P<0.05)，對類胡蘿卜素含量和葉綠素a/b值影響不顯著。可見，接種OM真菌能顯著提高鐵皮石斛幼苗葉綠素含量，提高葉片光合作用，促進鐵皮石斛幼苗的生長。

2.3 OM真菌對鐵皮石斛植株光合特性的影響

由表4可知，接種OM真菌顯著提高了鐵皮石斛葉片的Pn、Gs和Tr，但對Ci影響不顯著。由光響應(yīng)曲線(圖1，A)可知，隨著光照強度的增大，鐵皮石斛的Pn由負(fù)值開始不斷上升，隨后，Pn開始下降。在光照強度處于50～800 μmol·m-2·s-1之間時，接種OM真菌的鐵皮石斛葉片始終具有較大的凈光合速率，在光強為300 μmol·m-2·s-1時，凈光合速率達(dá)到最大，而未接種組在光強為200 μmol·m-2·s-1時，凈光合速率最大。說明接種OM真菌增強了鐵皮石斛對光強的適應(yīng)性。由二氧化碳響應(yīng)曲線(圖1，B)可知，隨著CO2濃度的升高，其所對應(yīng)的Pn快速上升，在CO2濃度達(dá)到400 μmol·m-2·s-1左右時，Pn達(dá)到最大，并隨著CO2濃度的繼續(xù)升高緩慢下降。OM真菌對二氧化碳響應(yīng)曲線影響不顯著，說明OM真菌不影響鐵皮石斛對環(huán)境CO2的需求。

表2 OM真菌處理下鐵皮石斛幼苗生長情況

注：表中各列的不同字母表示0.05水平差異顯著；-M. 未接種OM真菌(對照)；+M. 接種OM真菌；下同

Note：The same column normal letters in table are significantly different among treatments at 0.05 level; -M. Non-inoculated OM fungi (control); +M. Inoculated OM fungi; The same as below

表3 OM真菌處理下鐵皮石斛葉綠素和類胡蘿卜素含量變化

表4 OM真菌處理下鐵皮石斛葉片光合參數(shù)變化

圖1 OM真菌處理下鐵皮石斛葉片的Pn-PAR響應(yīng)曲線 (A)和Pn-CO2 響應(yīng)曲線(B)Fig.1 Response curve of the net photosynthetic rate to different photosynthetic photon flux densities (A) and different concentrations of CO2 (B) in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatments

2.4 OM真菌對鐵皮石斛植株葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

從表5可以看出，OM真菌能提高鐵皮石斛Fm、Fv/Fm和Fv/F0的值，提高了鐵皮石斛PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率和PSⅡ反應(yīng)中心潛在活性，能把所捕獲的光能高效轉(zhuǎn)化為植物所需的化學(xué)能。

圖2表示qP、qN、Yield和ETR等熒光參數(shù)對光照強度的響應(yīng)。由圖2，A可知，qN隨著光強的增大而增大，而qP隨著光強的增大而降低(圖2，B)，接種OM真菌均能提高qP和qN的值，進而提高鐵皮石斛PSⅡ?qū)⑺东@的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的效率，增強了鐵皮石斛耗散過剩的光能為熱的能力，提高光合機構(gòu)的自身保護能力。圖2，C顯示，Yield隨光強的增大而降低，在同一光量子通量下，接種OM真菌的鐵皮石斛的Yield較高，而對照組較低，這與上述光化學(xué)猝滅系數(shù)的結(jié)果相對應(yīng)，說明OM真菌提高了PSⅡ光能捕獲效率。ETR隨光強變化曲線如圖2，D所示，在低光強下，接種OM真菌與對照組鐵皮石斛的ETR無明顯差異，當(dāng)光強超過100 μmol·m-2·s-1時，隨著光強的增加，接種OM真菌的鐵皮石斛的ETR增加更快，在光強為600 μmol·m-2·s-1時，對照組受到抑制開始下降，而接種OM真菌組在800 μmol·m-2·s-1時，才受到抑制。可見，接種OM真菌能提高鐵皮石斛的ETR值，激發(fā)鐵皮石斛潛在的光合能力。

表5 OM真菌處理下鐵皮石斛葉片部分葉綠素?zé)晒鈪?shù)比較

圖2 OM真菌處理下鐵皮石斛葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)比較Fig.2 Comparison of chlorophyll fluorescence parameters in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatments

2.5 OM真菌對pepc基因表達(dá)的影響

鐵皮石斛是CAM植物，由PEPC催化固定CO2形成蘋果酸。因此pepc基因表達(dá)量的高低對鐵皮石斛光合速率具有重要影響，對鐵皮石斛的生長起著決定作用。圖3表示了鐵皮石斛葉片不同生長時期pepc基因的表達(dá)情況，由圖3可知，在鐵皮石斛幼苗生長1個月時，接種菌根真菌和對照組pepc基因表達(dá)量差異不大，隨著培養(yǎng)時間的延長，接種OM真菌的葉片pepc基因表達(dá)量顯著高于對照組，說明OM真菌能促進pepc基因的表達(dá)。由圖4可知，接種OM真菌顯著提高了PEPC活性，接種OM真菌植株的PEPC活性變化與接種OM真菌植株的pepc基因表達(dá)變化一致，研究表明，OM真菌通過誘導(dǎo)pepc基因的表達(dá)提高PEPC的活性，進而提高鐵皮石斛葉片光合碳同化能力。

圖3 OM真菌處理下鐵皮石斛pepc基因的表達(dá)Fig.3 Expression of pepc gene in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatments

圖4 OM真菌處理下鐵皮石斛葉片PEPC活性變化Fig.4 The changes of PEPC activity in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatments

3 討 論

光合作用是植物生長的基礎(chǔ)，是植物體內(nèi)重要的生理代謝過程，光合作用的強弱對植物的生長具有重要影響。植物的光合作用受到各種環(huán)境因素的影響，如植物受到菌根真菌侵染時，葉片中葉綠素含量、Pn、Gs和Tr均會發(fā)生變化，從而影響植物的光合作用[17]。在植物與真菌共生過程中，真菌通過提高植物的光合效率，促進碳水化合物的積累來滿足真菌對碳源的需求[18]。葉綠素是植物進行光合作用的重要色素，其含量高低反映了植物光合能力的大小[19]。本研究結(jié)果表明，接種OM真菌能提高鐵皮石斛葉片中葉綠素含量，葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，但Ci變化不明顯。OM真菌能夠促進葉綠素的合成，提高鐵皮石斛的光合能力。葉片氣孔導(dǎo)度升高有利于氣體和水分交換，是植物光合作用控制因素之一。鐵皮石斛屬于CAM植物，其光合碳同化途徑在CAM和C3途徑間轉(zhuǎn)換，強光照射會導(dǎo)致葉片氣孔關(guān)閉，影響氣體交換。在接種OM真菌情況下，鐵皮石斛葉片Gs升高，但Ci并未降低，導(dǎo)致Gs升高的原因可能與菌根的形成促進了水分的運轉(zhuǎn)有關(guān)，從而有利于菌根苗氣體交換[20]，促進CO2的吸收，使Ci保持在一定水平，提高植物的光合作用。

葉綠素?zé)晒鈦碜怨夥磻?yīng)系統(tǒng)(PSⅡ)的天線色素，葉綠素?zé)晒獾淖兓从沉酥参锏墓夂仙頎顩r以及多種因素對植物光合作用的影響。如干旱[21]和鋁[22]脅迫降低了植物葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，影響了植物光合性能。菌根真菌能提高植株葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，改善植物光合性能。如杜鵑花菌根真菌能顯著提高葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)，改善杜鵑花幼苗的光合性能，促進杜鵑花幼苗的生長[23]。本研究也表明，鐵皮石斛幼苗接種菌根真菌后，葉綠素?zé)晒鈪?shù)有所提高，這與上述前人研究相似。Fv/Fm和Fv/F0值提高，說明PSⅡ的實際光能捕獲效率較高，能把所捕獲的光能更多地用于光化學(xué)反應(yīng)，增強了植株對有效光的利用，提高植物葉片的凈光合速率。qP、Yield和ETR升高有利于提高植物的光能轉(zhuǎn)化效率以及對強光的適應(yīng)性，為暗反應(yīng)的光合碳同化積累更多的能量，促進碳同化的高效運轉(zhuǎn)和有機物的積累[24-25]。qN提高，表明葉片PSⅡ天線色素吸收的光能以熱的形式耗散掉的部分較多，對提高自身光合機構(gòu)的保護具有積極作用，增強了鐵皮石斛對環(huán)境的適應(yīng)能力。

鐵皮石斛屬于CAM植物，隨著環(huán)境條件的變化，其光合作用在CAM和C3途徑間變化[26]。PEPC是催化CAM代謝途徑中固定CO2反應(yīng)的關(guān)鍵酶，因此，pepc基因高表達(dá)能提高植株的光合效率。本研究顯示，接種OM真菌能促進pepc基因的表達(dá)，提高PEPC的活性，促進光合碳同化。葉片中高PEPC活性可以引起氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中蘋果酸濃度的升高，促進氣孔張開，提高葉片光合速率[27]，這也可能是Gs升高的一個原因。鐵皮石斛屬于喜陰植物，一般不耐強光照射，光響應(yīng)曲線分析表明，OM真菌增強了鐵皮石斛對光強的耐受性，這可能與pepc基因表達(dá)提高了植株對光強耐受性有關(guān)[28]，具體機制還需進一步研究。

總之，接種OM真菌改善了鐵皮石斛的光合性能，促進了pepc基因的表達(dá)，增強了PEPC活性，提高了鐵皮石斛葉片固定CO2的能力，促進鐵皮石斛生長，提高了鐵皮石斛對環(huán)境的適應(yīng)能力。本研究初步確定了OM真菌對鐵皮石斛光合作用的影響，闡明了鐵皮石斛pepc基因的表達(dá)特性以及PEPC活性變化規(guī)律，為鐵皮石斛的菌根化栽培提供了依據(jù)。