吳紹華，張世鑫，田維敏

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所, 農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南儋州 571737)

巴西橡膠樹(shù)(簡(jiǎn)稱橡膠樹(shù))，一種多年生熱帶喬木，是天然橡膠的主要來(lái)源。天然橡膠由于具有良好的彈性、絕緣性、耐磨性及抗高溫等優(yōu)良特性被廣泛用作工業(yè)原材料。橡膠樹(shù)的乳管是一種特化的細(xì)胞，分化于維管形成層細(xì)胞，成列分布[1-2]，是天然橡膠合成和儲(chǔ)存的場(chǎng)所[3]。在天然橡膠生產(chǎn)中，人們通常通過(guò)周期性切割橡膠樹(shù)的樹(shù)皮切斷乳管(割膠)采集排出的膠乳提煉天然橡膠。割膠是橡膠樹(shù)的一種周期性傷害，研究表明，割膠創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致乳管的增加來(lái)增強(qiáng)植物保護(hù)傷口的潛力[4]。由于橡膠樹(shù)樹(shù)干樹(shù)皮中次生乳管的數(shù)量與天然橡膠產(chǎn)量顯著正相關(guān)，因此，開(kāi)展乳管分化機(jī)理的研究對(duì)于指導(dǎo)割膠生產(chǎn)和改良橡膠樹(shù)的產(chǎn)膠潛力具有重要的意義。由于橡膠樹(shù)幼嫩萌條的第1～2伸長(zhǎng)單位沒(méi)有次生乳管[2,5]，這有助于區(qū)分誘導(dǎo)的次生乳管。以橡膠樹(shù)萌條為材料，研究證實(shí)機(jī)械傷害、茉莉酸、冠菌素及曲古菌素A均能誘導(dǎo)次生乳管的分化[2,4,6-7]。傷害部位脫水引起的活性氧爆發(fā)導(dǎo)致內(nèi)源茉莉酸的積累是傷害誘導(dǎo)乳管分化的內(nèi)因[5]。由于乳管的形成是一種極其復(fù)雜的細(xì)胞分化的過(guò)程，目前對(duì)乳管分化調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)僅停留在細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及較淺顯的分子生物學(xué)層面，對(duì)于其他層面的調(diào)控機(jī)理認(rèn)識(shí)較少。DNA甲基化是一種保守的表觀遺傳修飾，在動(dòng)植物基因調(diào)控及基因組穩(wěn)定中起著重要的作用[8-10]。植物中的DNA甲基化主要發(fā)生在CG、CHG、CHH(H代表A, T, C)位點(diǎn)的胞嘧啶上[8,11]，其中CG位點(diǎn)上的胞嘧啶甲基化在植物中占的豐度最高[12-14]。DNA甲基化與很多的生物進(jìn)程有關(guān)，在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[10,15-17]、逆境脅迫[18-20]及細(xì)胞分化[21-23]中起著重要的作用。然而，對(duì)于表觀遺傳特別是DNA甲基化是否參與乳管分化的過(guò)程還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP)技術(shù)，探討了傷害處理橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮的DNA甲基化的變化，為進(jìn)一步從表觀遺傳學(xué)角度研究傷害誘導(dǎo)次生乳管的分化提供參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

巴西橡膠樹(shù)無(wú)性系‘熱研73397’植株，種植于海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所試驗(yàn)場(chǎng)。這些植株每年都被鋸干，由莖干基部的潛伏芽長(zhǎng)出萌條。萌條的頂芽在年生長(zhǎng)周期中通常活動(dòng)5～6次，這些葉簇中間隔一定長(zhǎng)度的無(wú)葉莖稈。每一個(gè)這種明顯的增長(zhǎng)形態(tài)被稱為伸長(zhǎng)單位(extension unit，EU)。在自然條件下，從頂端往下數(shù)EU1和EU2是沒(méi)有次生乳管的[2,5]。本研究取穩(wěn)定期萌條EU1為材料進(jìn)行處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1機(jī)械傷害處理及材料的采集對(duì)穩(wěn)定期萌條EU1的樹(shù)皮，采用單面刀片輕輕刮去萌條樹(shù)皮的上表皮后直接暴露于空氣中。分別于傷害處理后暴露0.5、1、2、4、8、24、48、72 h后采集傷害部位的樹(shù)皮，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集3株混合為一個(gè)樣品，液氮保存用于基因組DNA提取。不做任何處理的萌條樹(shù)皮樣品為對(duì)照。

1.2.2DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析采用DNAsecure Plant Kit(天根，北京)提取樹(shù)皮樣品的基因組DNA。MSAP分析包含的酶切、連接、PCR擴(kuò)增等參照Xiong等的方法[24]。采用2組限制性內(nèi)切酶組合分別對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切，其中EcoR Ⅰ+HpaⅡ酶組合標(biāo)記為EH，EcoR I+MspⅠ酶組合標(biāo)記為EM。酶切后進(jìn)行接頭連接及PCR，接頭及PCR擴(kuò)增引物序列如表1，從中選擇20對(duì)PCR引物進(jìn)行MSAP分析。PCR產(chǎn)物變性后采用6%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)進(jìn)行分離和銀染。采用“+”和“-”統(tǒng)計(jì)PAGE膠條帶，相同的位點(diǎn)有帶記為“+”，無(wú)帶記為“-”。

由于同裂酶HpaⅡ和MspⅠ對(duì)胞嘧啶甲基化的敏感性不同，根據(jù)酶組合EH和EM條帶的有無(wú)，可將MSAP條帶可分為4種類型(表 2)：類型 I 條帶為“+, +”，表明CCGG位點(diǎn)未甲基化；類型 Ⅱ 條帶為“+, -”，表明 CCGG 位點(diǎn)發(fā)生單鏈外部甲基化(CHG 甲基化/半甲基化)；類型 Ⅲ 條帶為“-, +”， 表明 CCGG 位點(diǎn)發(fā)生雙鏈內(nèi)部甲基化(CG甲基化/全甲基化)；類型 Ⅳ 條帶為“-, -”，表明CCGG位點(diǎn)全甲基化[25-26]。甲基化水平采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：總甲基化率(%)=[(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100，全甲基化率(%)=[(Ⅲ+Ⅳ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100，半甲基化率(%)=[(Ⅱ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100。

1.2.3目的條帶的回收、測(cè)序及序列分析從PAGE膠切下DNA甲基化差異位點(diǎn)條帶，采用高鹽法[27]回收目的片段，進(jìn)行二次PCR后用pMD19-T Clone kit (TaKaRa)克隆差異片段后進(jìn)行測(cè)序。用DNAMAN軟件去除載體序列后，采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站的nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (Blastn) 和translated DNA Blast (Blastx)工具進(jìn)行序列的同源比對(duì)。

表1 用于MSAP分析的接頭和引物序列

1.2.4重亞硫酸鹽測(cè)序采用Epitect Plus DNA Bisulfite Kit (Qiagen, USA)試劑盒對(duì)差異位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的DNA樣品進(jìn)行重亞硫酸鈉處理，處理后的DNA采用Premix TaqTM(TaKaRa, Japan)聚合酶進(jìn)行甲基化特異性PCR擴(kuò)增，引物采用MethPrimer[28]進(jìn)行設(shè)計(jì)。編號(hào)15-1和45-2位點(diǎn)的擴(kuò)增引物為15-1F(5′-ATTTTTAAATTATTGAGGGTTCG-AC-3′)和15-1R(5′-TTCTAATAAAATTATTAATTCCGCA-3′)；45-2F(5′-TTCGTAGGATTTTAATT-CGTTTATTC-3′)和45-2R(5′-CTACTACCAACAATCTTTCTTCGAA-3′)。PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，并采用CyMATE[29]軟件對(duì)胞嘧啶甲基化進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)重亞硫酸鈉處理樣品與未處理樣品的DNA序列進(jìn)行分析，如胞嘧啶(cytosine，C)轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶(thymine，T)表示胞嘧啶沒(méi)有發(fā)生甲基化，如胞嘧啶無(wú)轉(zhuǎn)換則表示胞嘧啶發(fā)生甲基化。

2 結(jié)果與分析

2.1 傷害處理橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮DNA胞嘧啶甲基化水平分析

本研究從32對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合(表1中E1～E4分別與HM1～HM8配對(duì))中，篩選出條帶多態(tài)性及清晰度較好的20對(duì)引物，分別為E1+HM5、E1+HM7、E2+HM1、E2+HM3、E2+HM4、E2+HM5、E2+HM6、E2+HM7、E2+HM8、E3+HM1、E3+HM2、E3+HM3、E3+HM4、E3+HM7、E3+HM8、E4+HM1、E4+HM2、E4+HM3、E4+HM5、E4+HM8，對(duì)萌條樹(shù)皮基因組DNA的CCGG位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化進(jìn)行MSAP分析(圖 1)，共檢測(cè)到了688個(gè)位點(diǎn)(表2)。在對(duì)照樣品中，即自然狀態(tài)下萌條樹(shù)皮的甲基化水平為29.51%，其中全甲基化(類型Ⅲ+Ⅳ)占的比重較大，為27.76%。而傷害后暴露不同時(shí)間的樣品，其甲基化水平變化范圍為26.16%～29.94%(表2)，其中傷害處理0.5、2和8 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的甲基化水平比對(duì)照略有升高，升高幅度較低，只有0.4%左右。而傷害處理1、4、24、48和72 h的甲基化水平比對(duì)照有所下降，其中甲基化水平下降幅度最大是發(fā)生在傷害處理48 h后，下降幅度達(dá)到了3.35%。與對(duì)照相似，傷害處理樣品的全甲基化(類型Ⅲ+Ⅳ)占甲基化水平的比重也較大(表2)。而相比對(duì)照的半甲基化比率(1.74%)，只有48(1.60%)和72 h(1.31%)樣品的半甲基化位點(diǎn)比率有較低幅度的降低。因此，甲基化水平的變化主要是由于全甲基化(類型Ⅲ+Ⅳ)位點(diǎn)的改變。

2.2 傷害處理橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮DNA胞嘧啶甲基化變化類型的分析

與對(duì)照相比，當(dāng)PAGE膠上同一位置的條帶由于傷害處理發(fā)生了變化，說(shuō)明此位點(diǎn)的甲基化模式發(fā)生了改變。為了闡明傷害處理導(dǎo)致橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮DNA甲基化變化的程度和類型，對(duì)PAGE條帶的統(tǒng)計(jì)和分析結(jié)果(表3)顯示，傷害處理與對(duì)照相比，存在13種DNA甲基化類型，依次將其命名為類型A～M(表3)。這些甲基化類型可以歸納為3大類：DNA甲基化無(wú)變化、去甲基化和甲基化。其中DNA甲基化無(wú)變化包含A～D 4種類型，對(duì)照和傷害處理的DNA甲基化是一致的；E～I(xiàn) 5種類型代表的是胞嘧啶去甲基化，即傷害處理導(dǎo)致CCGG位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化；J～M 4種類型代表的是胞嘧啶的甲基化，即傷害處理導(dǎo)致CCGG位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。與對(duì)照相比，超過(guò)94% CCGG位點(diǎn)在傷害處理時(shí)甲基化保持不變。傷害處理0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h后，去甲基化發(fā)生的概率分別為0.14%、1.89%、0.29%、1.31%、0.29%、2.18%、4.22%、1.31%；甲基化發(fā)生的概率分別為0.73%、0.44%、3.78%、0.87%、0.87%、0.87%、1.02%、0.73% (表 3)。去甲基化事件發(fā)生頻率最高的是在傷害處理48 h(4.22%)，而甲基化事件則主要發(fā)生在傷害處理2 h后(3.78%)。這與甲基化水平的變化趨勢(shì)是一致的，與對(duì)照的甲基化水平29.51%相比，傷害處理2 h的甲基化水平升高至29.94%，傷害處理48 h的甲基化水平下降至26.16%。

圖1 MSAP分析膠圖Fig.1 The PAGE of MSAP analysis

類型 Type帶型Band傷害處理時(shí)間Time after wound treatment/ hEHEM對(duì)照Control0.5 1 24 8 24 48 72 Ⅰ++485482497482489483496508489Ⅱ+-12131312131312119Ⅲ-+164165155146159163151161163Ⅳ--27282348272929827總位點(diǎn)Total sites688688688688688688688688688總甲基化位點(diǎn)Total methylated sites203206191206199205192180199總甲基化率Total methylated rate/%29.5129.9427.7629.9428.9229.8027.9126.1628.92全甲基化位點(diǎn)比率Fully methylated rate/%27.7628.0525.8728.2027.0327.9126.1624.5627.62半甲基化位點(diǎn)比率Hemimethylated rate/%1.741.891.891.741.891.891.741.601.31

注：+表示有條帶，-表示無(wú)條帶；下同

Note: + represented the bands presented, - represented no bands; The same as below

2.3 差異DNA甲基化片段的分析及重亞硫酸鹽測(cè)序驗(yàn)證

通過(guò)比較對(duì)照和傷害處理的甲基化狀況，回收PAGE膠相應(yīng)的甲基化差異位點(diǎn)，鑒定了20條DNA甲基化差異片段序列，片段的長(zhǎng)度范圍為102～459 bp，其中有8個(gè)片段與橡膠樹(shù)‘熱研73397’的基因組序列匹配[30]，這些序列的DNA甲基化變化主要發(fā)生在基因的外顯子及UTR區(qū)(表 4)。比對(duì)分析顯示，這些片段匹配的基因注釋為ATP 合酶F1亞基1、磷酸核糖胺-甘氨酸類連接酶、冷激結(jié)構(gòu)域蛋白3、光系統(tǒng)Ⅱ 47 kDa 蛋白、E3泛素蛋白連接酶RING1、NADH泛醌氧化還原酶和一些假定蛋白(表 4)。其中，采用重亞硫酸鹽測(cè)序?qū)TP 合酶F1亞基1(15-1)和NADH泛醌氧化還原酶(45-2)的甲基化進(jìn)行了驗(yàn)證。重亞硫酸鹽測(cè)序結(jié)果表明，與對(duì)照相比，這2個(gè)CCGG位點(diǎn)受傷害處理后均發(fā)生了去甲基化，與PAGE膠顯示的結(jié)果一致(圖 2)。

表3 傷害處理橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮DNA甲基化與對(duì)照比較

表4 DNA甲基化差異位點(diǎn)的匹配基因的功能注釋

圖2 15-1 (a) 和 45-2 (b)甲基化差異位點(diǎn)重亞硫酸鹽測(cè)序結(jié)果Fig.2 The bisulfite sequencing analysis of the CCGG sites in 15-1 (a) and 45-2 (b)

3 討 論

胞嘧啶甲基化是一種主要的甲基化修飾，與轉(zhuǎn)錄沉默具有密切的相關(guān)性[31]。MSAP技術(shù)常用來(lái)檢測(cè)胞嘧啶甲基化的改變和分離基因組中隨機(jī)分布的甲基化位點(diǎn)[24,32-33]。本研究采用MSAP技術(shù)首次分析了傷害處理橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮的甲基化變化及模式。機(jī)械傷害處理萌條1 h導(dǎo)致甲基化水平的下降，2 h后甲基化水平恢復(fù)至對(duì)照水平并有所升高，這種變化趨勢(shì)與玉米葉片的受傷害后DNA甲基化的變化相似：傷害1 h導(dǎo)致玉米的DNA甲基化水平瞬時(shí)下降至20%～30%，隨后恢復(fù)至原先的水平[34]。除此之外，機(jī)械傷害處理橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮還有一個(gè)效應(yīng)，就是傷害暴露能誘導(dǎo)萌條次生乳管的產(chǎn)生。在本研究中，傷害處理橡膠樹(shù)萌條24 h和48 h，甲基化水平分別降至27.91%和26.16%。而且，甲基化變化模式分析表明，超過(guò)94%的甲基化位點(diǎn)在傷害處理后沒(méi)有發(fā)生變化。甲基化事件主要發(fā)生在2 h(3.78%)，去甲基化事件主要發(fā)生在48 h(4.22%)。

另外，對(duì)8個(gè)匹配基因組的DNA甲基化差異位點(diǎn)的功能注釋顯示，傷害導(dǎo)致6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生去甲基化，分別是ATP合酶F1亞基1、光系統(tǒng)Ⅱ 47 kD 蛋白、E3泛素蛋白連接酶RING1、NADH泛醌氧化還原酶和2個(gè)假定蛋白；傷害導(dǎo)致位點(diǎn)發(fā)生甲基化的有磷酸核糖胺-甘氨酸類連接酶和冷激結(jié)構(gòu)域蛋白。ATP合酶F1亞基1和NADH泛醌氧化還原酶是電子傳遞鏈中組分，與活性氧的產(chǎn)生或消除相關(guān)。E3泛素蛋白連接酶主要包含3大類：HECT結(jié)構(gòu)域家族、RING結(jié)構(gòu)域家族及U-box蛋白家族。有研究表明，RING型E3泛素連接酶通過(guò)介導(dǎo)植物的多個(gè)信號(hào)途徑參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)[35]。橡膠樹(shù)傷害誘導(dǎo)的次生乳管分化主要是傷害部位暴露脫水引起的內(nèi)源茉莉酸大量積累有關(guān)[5]。因此，傷害導(dǎo)致了相關(guān)基因發(fā)生了甲基化或去甲基化，是否會(huì)參與次生乳管的發(fā)育？這一推斷有待于進(jìn)一步的深入研究。