余振偉，王學慧

近年來，以生長因子和細胞療法為治療手段的生物療法在心力衰竭（心衰）的動物模型中得以廣泛研究，旨在促進自身心肌細胞的修復來有效改善慢性心衰（CHF）[1]。神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長因子（neuregulin-1β）為一類心肌表皮生長因子（EGF），可激動上皮生長因子酪氨酸酶受體[2]，研究表明，neuregulin-1β具有抑制大鼠心肌細胞凋亡、促進大鼠心肌細胞增殖和DNA合成的作用，同時neuregulin-1β可使離體的大鼠心肌細胞免受阿霉素誘導的凋亡影響[2]，但neuregulin-1β對阿霉素誘導的慢性心衰的大鼠體內(nèi)心功能的影響尚未可知。相關研究表明促血管生成素（Ang2）、大麻素受體（CB1）、蛋白激酶C（PKC）均參與慢性心衰的調(diào)節(jié)[3-5]，但neuregulin-1β在促進心肌細胞生長和保護心肌細胞同時對Ang2、CB1、PKC表達的影響尚未有相關性研究。因此，本研究擬建立阿霉素誘導的心衰大鼠模型，探討neuregulin-1β對慢性心衰大鼠心功能的影響，并進一步研究neuregulin-1β對大鼠Ang2、CB1、PKC表達的影響，以期深入闡釋neuregulin-1β抗心衰的作用及其相關機制，為臨床慢性心衰的治療提供新的治療途徑。

1 資料和方法

1.1 實驗動物健康雄性SD大鼠（體質(zhì)量150～200 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-2-006，動物批次號：201607012。

1.2 藥品與試劑注射用鹽酸阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：1606E1），neuregulin-1β（上海澤生科技開發(fā)有限公司，批號：201608016）。CB1（美國Cayman Chemical公司），Ang2單克隆抗體（美國Cayman Chemical公司），PV-6000免疫組化試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司），DAB顯色液（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。PKC一抗（美國Santacruz公司，批號：sc-10802），二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司，批號：ZB- 2303）。

1.3 實驗儀器彩色多普勒超聲心動圖儀（GE Vivid 7，USA），生理記錄儀及RM6280多導生物信號處理系統(tǒng)（浙江醫(yī)科大學醫(yī)療儀器實驗廠），光學顯微鏡及其成像系統(tǒng)（LEICA DMIRB，Germany），漩渦混勻器（德國LEICA公司），Shan-don325型石蠟切片機（英國Shandon 公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組將30只SD大鼠隨機分為模型組、neuregulin-1β干預組、正常組，每組10只。模型組：尾靜脈注射阿霉素（20 mg/kg），1/周，連續(xù)8周，完成CHF造模；neuregulin-1β干預組：完成與模型組相同的造模后，尾靜脈每天給予neuregulin-1β（10 μg/kg·d），連續(xù)1周；正常組：尾靜脈注射與模型組等體積的生理鹽水，1/周，連續(xù)8周。

1.4.2 大鼠心臟超聲及血流動力學檢測模型組與neuregulin-1β干預組分別在用藥8周后及neuregulin-1β連續(xù)干預1周后腹腔注射2%的戊巴比妥麻醉大鼠，以HP嚙齒動物超聲探頭（15 MHz）在大鼠胸骨旁以二維超聲和M型超聲進行心臟形態(tài)和功能檢測。測量指標包括左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd），左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd），左室縮短率（LVFS），左室射血分數(shù)（LVEF）。三組大鼠均在實驗開始第9周末于麻醉后剪開頸部皮膚，暴露右側(cè)頸總動脈后插入聚苯乙烯左心導管（外徑1.0 mm，內(nèi)徑0.8 mm）至左心室，左心導管另一端連接八導電生理記錄儀觀察，記錄各血流動力學指標：左心室收縮壓（LVSP），左心室舒張末期壓（LVEDP），左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax），左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）。隨后取出心臟標本并投放液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 大鼠心肌組織病理學檢測各組大鼠被處死時，取左心室部分心肌，用10%的福爾馬林固定后蠟塊包埋并切片，行HE染色，每組3張，進行病理學觀察。

1.4.4 Western blot法檢測大鼠心肌組織中PKC蛋白的表達[6]將大鼠心肌組織低溫研磨后裂解，提取總蛋白，BCA蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，后與一抗、二抗孵育，通過化學發(fā)光法獲取條帶，使用IPP 6.0軟件分析目的條帶灰度，計算PKC 蛋白的相對表達量。

1.4.5 免疫組織化學法檢測大鼠心肌組織中Ang2蛋白、CB1蛋白的表達[7,8]SP法檢測心肌組織中CB1和Ang2的表達，已知陽性片為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照，進行半定量評分：①光鏡下按細胞顯色有無及深淺記分：無色為0分；淺色為1分；深色為2分。②按顯色細胞所占比例評分：占1/2以下為1分；占1/2以上為2分。上述兩分值之乘積為最終評分：陰性為0分（-）；弱陽性為1～2分（+）；強陽性為3～4分（+ +）。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間差異采用one-way ANOVA檢驗，統(tǒng)計前首先對各個檢測指標數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗；方差分析有差異時，則進一步采用LSD-t法進行兩兩比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠心臟超聲及血流動力學指標檢測結(jié)果模型組和干預組在第8周neuregulin-1β用藥前LVEDd、LVESd均高于正常組（P＜0.05），LVFS與LVEF均低于正常組（P＜0.01）；但干預組心臟超聲各指標與模型組相比均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），表明連續(xù)8周的阿霉素用藥成功建立慢性心衰大鼠模型（表1）。

表1 三組大鼠第8周及第9周時超聲心電圖心功能指標（±s，n=10）

表1 三組大鼠第8周及第9周時超聲心電圖心功能指標（±s，n=10）

注：LVEDd：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVESd：左心室收縮末期內(nèi)徑；LVFS： 左室縮短率；LVEF：左室射血分數(shù)；與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05；與第8周干預組比較，dP＜0.05

第9周指標/組別 正常組 模型組 干預組 正常組 模型組 干預組LVEDd（mm） 5.4±0.2 7.1±0.1a 6.9±0.2a 5.5±0.1 7.5±0.2a 6.0±0.5acd LVESd（mm） 2.7±0.2 4.3±0.2a 4.4±0.3a 2.8±0.4 4.5±0.4a 3.4±0.3acd LVFS（%） 51.6±1.3 38.7±0.8b 40.2±1.6b 53.2±2.1 35.6±1.3b 46.7±1.8ac LVEF（%） 83.6±2.1 67.8±3.2b 64.5±1.6b 85.7±1.8 63.4±2.7b 78.6±2.3ac時間 第8周

neuregulin-1β干預1周后，干預組LVEDd、LVESd均高于正常組（P＜0.01），但均低于模型組（P＜0.05）；干預組LVFS與LVEF均低于正常組（P＜0.05），但均高于模型組（P＜0.05）；且干預組neuregulin-1β連續(xù)干預1周后LVEDd、LVESd均較干預前顯著降低（P＜0.05）（表1）。

neuregulin-1β干預1周后，干預組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均低于正常組（P＜0.05），但均高于模型組（P＜0.05）；干預組LVEDP高于正常組（P＜0.01），但低于模型組（P＜0.05）（表2）。

表2 三組大鼠血流動力學指標檢測結(jié)果（±s，n=10）

表2 三組大鼠血流動力學指標檢測結(jié)果（±s，n=10）

注：LVSP：左心室收縮壓；LVEDP：左心室舒張末期壓；-dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大下降速率；+dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大上升速率；與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

指標/組別 正常組 模型組 干預組LVSP（mmHg） 130.4±2.6 98.3±1.8b 117.8±3.2ac LVEDP（mmHg） 4.2±1.6 25.6±2.1b 14.6±2.6bc-dp/dtmax（mmHg/s） -5530.2±206.5 -2365.3±167.5b -3906.7±187.6ad+dp/dtmax（mmHg/s） 6400.7±344.2 3600.6±267.4b 4721.6±242.3bd

2.2 三組大鼠心肌組織病理學檢測結(jié)果正常組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列有序，橫紋清晰，未見心肌斷裂、出血及心肌細胞水腫變性，無顯著血管擴張、充血，未見心肌壞死及炎性細胞浸潤（圖1A）。模型組大鼠心肌間質(zhì)充血、出血明顯，血管明顯擴張，局灶性心肌出血，片狀心肌肌纖維斷裂，廣泛的心肌細胞水腫、變性，心肌斷裂壞死較為嚴重（圖1B）。干預組心肌病變輕于模型組，除部分心肌水腫外，未見明顯的心肌細胞壞死及炎癥浸潤，也未見明顯的血管充血擴張，且心肌細胞排列基本正常（圖1C）。

圖1 三組大鼠心肌組織HE染色病理結(jié)果圖示（×400）

2.3 三組大鼠PKC蛋白檢測結(jié)果模型組和干預組PKC相對蛋白量均高于正常組，但干預組PKC相對蛋白量低于模型組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（圖2）。

2.4 三組大鼠心肌組織中Ang2和CB1免疫組化檢測結(jié)果模型組和干預組Ang2和CB1陽性區(qū)域評分均高于正常組，但干預組Ang2和CB1陽性區(qū)域評分低于模型組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（圖3～4）。

圖2 三組大鼠PKC蛋白Western blot檢測結(jié)果圖示

3 討論

慢性心力衰竭是由多種病因誘發(fā)的器質(zhì)性心血管疾病，可導致心肌收縮力減弱和心臟泵血功能降低。最新流行病學調(diào)查表明：發(fā)達國家成年人群中CHF發(fā)病率為1%～3%，其中65歲以上的老年人群中高達10%，在我國CHF患病率為1.9%。此外，心衰患者的預后較差，病死率較高，重者可高達40%以上[9]。而傳統(tǒng)CHF的藥物并未產(chǎn)生顯著的血管“逆重構(gòu)”作用，未能顯著改善收縮功能。近年，基于心肌本身自有的生長因子為治療手段的生物療法在心衰的動物模型中得以廣泛研究，為CHF的治療開辟新路徑。

圖3 三組大鼠Ang-2蛋白免疫組化檢測結(jié)果圖示（×200）

neuregulin-1β參與細胞內(nèi)多個信號級聯(lián)通路（包括Raf/MEK/ERK通路、PI3K/AKT，JNK和cdk5等）發(fā)揮促進心肌細胞生長和保護心肌細胞等的作用[10]，該研究表明，neuregulin-1β的干預有效減輕阿霉素誘導的CHF大鼠心肌損傷，改善各項心功能指標，糾正心衰，此外，neuregulin-1β的干預顯著改善大鼠心肌細胞的病變情況。已有研究結(jié)果顯示neuregulin-1β具有抑制大鼠心肌細胞凋亡、促進大鼠心肌細胞增殖和DNA合成的作用，同時neuregulin-1β可使離體的大鼠心肌細胞免受阿霉素誘導的凋亡影響[11]，但上述研究僅在細胞水平做探討，本研究進一步在動物體內(nèi)尤其是驗證neuregulin-1β對于阿霉素誘導的CHF的保護作用。

進一步的研究結(jié)果顯示neuregulin-1β對CHF大鼠的保護作用可能與下調(diào)Ang2、CB1、PKC的表達密切相關。研究表明CB1受體激動劑可導致大鼠離體心臟心率減慢，心臟收縮和舒張程度降低，同時表明CB1受體參與大鼠心率和心肌收縮性的調(diào)節(jié)[12]，neuregulin-1β可能通過下調(diào)CB1受體的表達而調(diào)節(jié)CHF大鼠的心率；Ang家族是一類特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的調(diào)節(jié)因子，研究表明Ang2可競爭性地抑制Ang1穩(wěn)定血管的作用，在生長因子存在的條件下，Ang2可以加強生長因子的促血管生成作用，誘導血管出芽和重建[13]，因此基于以上研究結(jié)果，neuregulin-1β可能通過下調(diào)Ang2而發(fā)揮抑制CHF大鼠心肌重構(gòu)的作用，同時neuregulin-1β明顯抑制PKC的表達，這可能與PKC參與阿霉素介導的心肌肥大有關，當發(fā)生心衰時，不同亞型的 PKC表達均有所提高[14]，通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，與正常心肌細胞相比較，PKC 在心衰細胞中可作為肥大信號傳導，同時其活性明顯增加，但有待于進一步實驗研究。

圖4 三組大鼠CB1蛋白免疫組化檢測結(jié)果圖示（×200）

綜上所述，neuregulin-1β的干預明顯改善CHF大鼠各項心功能指標及大鼠心肌細胞的病變情況，而其作用機制可能與下調(diào)Ang2、CB1、PKC的表達密切相關。