唐珊珊，徐友華

澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，澳門 999078

中性粒細胞作為機體的第一道防線，在非特異性免疫和感染初期的防御中均具有十分重要的作用。當(dāng)機體遭到病原微生物侵襲，尤其當(dāng)化膿性細菌入侵時，中性粒細胞隨即被激活，通過脫顆粒釋放抗菌蛋白進入到胞外環(huán)境中或者直接吞噬入侵的病原菌以此來發(fā)揮抗炎作用。有相關(guān)研究表明，當(dāng)組織遭到病原微生物感染后，經(jīng)白介素8(IL-8)、佛波酯(PMA)和脂多糖(LPS)等的刺激活化后，中性粒細胞可釋放出一種纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps，NETs)。其可網(wǎng)羅、殺傷病原體從而參與機體自身的免疫應(yīng)答。筆者將從NETs的形成及其殺滅病原微生物的作用等方面著手，對NETs在自身免疫性疾病(Autoimmune disease，AID)發(fā)生發(fā)展中所起到的影響進行闡述；同時還將重點探討中藥對NETs的影響及中藥在治療AID中發(fā)揮的作用。

1 NETs的概述

1.1 NETs的形成 中性粒細胞在機體抵御病原微生物入侵時發(fā)揮重要作用，是非特異性免疫的重要組成成分。NETs的形成是一種新的死亡程序，它區(qū)別于凋亡和壞死。NETs的組成包括細胞內(nèi)解聚的DNA、組蛋白、顆粒成分和30多種胞漿蛋白。其形成過程為：最初，中性粒細胞通過收縮，細胞核膨脹；然后，核膜形成雙分子層結(jié)構(gòu)，失去了核染色質(zhì)；核染色質(zhì)進入細胞質(zhì)，細胞質(zhì)失去了完整性；一些顆粒物質(zhì)如髓過氧化物酶、抗菌肽(LL37)和彈性蛋白酶(Elastase)等和染色質(zhì)相結(jié)合。這些酶類可導(dǎo)致周圍相關(guān)蛋白如彈性蛋白酶進一步催化并可部分或特異地降解組蛋白和促進細胞核去致密化；最后，胞漿膜很快破裂，形成了NETs[1]。誘導(dǎo)機制及細胞死亡途徑的不同證明了網(wǎng)捕死亡(NETosis)與中性粒細胞的凋亡有很大的區(qū)別。NETs的形成依賴細胞內(nèi)肽?；彼崦搧啺访?(PAD4)的作用；炎癥刺激下的中性粒細胞可誘導(dǎo)大量的PAD4活性生成，而在細胞凋亡中，PAD4則受到抑制。此外中性粒細胞形成NETs過程中細胞膜會破裂，而凋亡細胞通過凋亡途徑產(chǎn)生的凋亡小體是一個完整細胞膜包被的整體[2]。因此，NETosis是不同于細胞凋亡和壞死的另一種程序性死亡途徑。

1.2 NETs殺滅病原微生物的機制 中性粒細胞作為非特異性效應(yīng)細胞，在自身免疫應(yīng)答中吞噬病原體后隨即凋亡。其凋亡的結(jié)果使自身組織免受中性粒細胞活化后產(chǎn)生的蛋白酶的氧自由基的破壞。在微生物或細胞因子的作用下，因中性粒細胞的凋亡被抑制，使得中性粒細胞得以持續(xù)活化，進而導(dǎo)致其他細胞的非特異性損傷且招募其他炎性細胞的聚集[3]。中性粒細胞可通過形成NETs，達到識別和誘捕細菌、真菌和寄生蟲，甚至某些病毒的目的，并且通過組蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、過氧化物酶(MPO)、活性氧(ROS)、抗菌肽LL37等抗菌物質(zhì)的大量表達，在局部形成了高濃度的殺菌環(huán)境迅速殺滅病原微生物[4]。在慢性炎癥性疾病過程中，均可導(dǎo)致NETs的形成。

1.3 NETs的組織損傷效應(yīng) NETs在抗病原微生物過程的重要作用眾所周知，而NETs的形成是以損傷自身機體細胞為代價的。NETs的形成或是清除不及時，都會給機體造成不良的作用。多種病理過程中都可見到NETs的組織損傷效應(yīng)[5]。例如，發(fā)生嚴重的膿毒血癥時，機體內(nèi)的血小板與中性粒細胞相互作用以及Toll樣受體(TLRs)信號通路的激活，可使NETs快速形成，它能誘捕并殺滅病原微生物，但同時也會造成對血管內(nèi)皮細胞的損傷[6]。NETs還能在損傷的血管處形成支架，導(dǎo)致血栓形成[7]。再者，除外NETs的整體結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生損傷，其組成成分如組蛋白、顆粒酶、活性氧均可引起組織的損傷效應(yīng)。

此外，因NETs的形成伴隨著大量自身抗原的暴露，從而可引發(fā)或加重自身免疫病。2009年Kessenbrock K等[8]報道小血管炎患者的ANCA可刺激中性粒細胞釋放NETs，其由MPO和蛋白酶3(PR3)組成；小血管炎處于活動期的病人血清中NETs的水平明顯升高。以上研究表明了NETs可通過呈遞抗原及介導(dǎo)血管損傷參與小血管炎的病理過程。不僅如此，現(xiàn)在越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，NETs在自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了非常重要的作用。

2 NETs與自身免疫性疾病的研究進展

2.1 NETs與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA） RA是一種以炎性滑膜炎特點的慢性自身免疫性疾病，是最常見的炎性關(guān)節(jié)病，其發(fā)病機制至今尚未完全闡明。主要病理特征表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎滑膜系統(tǒng)性炎癥引起的關(guān)節(jié)軟骨和骨侵蝕[9]。中性粒細胞在RA的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。在RA發(fā)生的早期，中性粒細胞通過分泌大量的炎性介質(zhì)，造成組織的炎性損傷。另外，NETs是RA瓜氨酸化的自身抗原的重要來源之一，且抗-瓜氨酸蛋白抗原可誘導(dǎo)RA炎癥反應(yīng)[10]。NETs參與了早期RA病人自身抗體的產(chǎn)生過程。因此，中性粒細胞是治療RA的重要靶點。陳本露等[11]通過臨床實驗，收集了88例RA患者空腹外周靜脈血，應(yīng)用PicoGreen dsDNA定量試劑盒測其血清中游離DsDNA/NETs，結(jié)果顯示RA患者血清中dsDNA/NETs的濃度高于健康對照組，提示中性粒細胞可能通過形成NETs參與RA的發(fā)生發(fā)展。Khandpur R等[12]發(fā)現(xiàn)，RA病人的中性粒細胞形成NETs的能力要比正常人強。

2.2 NETs與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE） SLE是一種以抗核抗體產(chǎn)生及免疫復(fù)合物聚集為特征的自身免疫系統(tǒng)疾病，可累及多系統(tǒng)、多器官[13]。在NETs的產(chǎn)生過程中，大量的DNA和組蛋白被釋放并暴露于細胞表面，若產(chǎn)生后不能得到及時地清除，可能會形成自身抗原而引起自身抗體的產(chǎn)生，形成免疫復(fù)合物，進一步使某些炎性細胞因子受到刺激而加強分泌，因而SLE的發(fā)病機制可能與NETs有密切的關(guān)系[14]。有研究表明，SLE患者的體內(nèi)可以產(chǎn)生脫氧核糖核酸酶Ⅰ抑制劑或是形成NETs相應(yīng)抗體，導(dǎo)致機體降解NETs的能力下降，故而加重SLE疾病進展[15]。此外，Leffler J等[16]發(fā)現(xiàn)，SLE患者血清中的補體可以和不能完全降解的NETs相結(jié)合，這又是導(dǎo)致其降解能力降低的原因之一；并證實了NETs在SLE組織中沉積并激活補體，使炎癥反應(yīng)進一步放大。Courtney PA等[17]利用流式細胞術(shù)進行分析，結(jié)果表明SL患者的外周血中死亡傾向的中性粒細胞數(shù)目增加且雙鏈DNA抗體水平也隨之增加，并且和SLE發(fā)展的嚴重程度呈正相關(guān)。Lande R等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在SLE患者的血清中性粒細胞顆粒肽LL37和雙鏈DNA所形成的免疫復(fù)合物(ICs)可以通過TLR9受體，并激活漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)，且可作為自身抗原激活β細胞產(chǎn)生自身抗體，表明激活NETs、pDCs與自身免疫有重要的聯(lián)系。蔣秋梅等[19]通過臨床實驗，收集了44例女性SLE患者空腹外周靜脈血，采用熒光亮度法定量測定NETs形成率，結(jié)果顯示女性SLE患者組NETs水平顯著高于健康對照組，表明SLE患者NETs形成增強。此外，SLE患者NETs水平與SLE疾病活動度評分呈正相關(guān)，表明NETs可能作為SLE嚴重程度的評價指標?？傊?，大量的實驗證明了NETs在SLE發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用。

2.3 NETs與糖尿病（DM） DM是一種以胰島素抵抗、慢性炎癥及β細胞受損為特征的慢性代謝性疾病。機體慢性低度炎癥狀態(tài)是糖尿病的重要特征之一[20]。外周血白細胞計數(shù)是重要的炎癥標志物，其通過釋放NETs達到殺死細菌的作用，并發(fā)揮促炎和促血栓作用。Carestia A等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NET可以作為2型糖尿病的生物標記，但NETs的升高與血糖控制及血栓形成無任何關(guān)聯(lián)，與促炎性細胞因子作用有關(guān)。Wang Y等[22]研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病患者血清中的彈性蛋白酶和蛋白酶3水平均升高，并且和β細胞自身的免疫程度呈正相關(guān)，證明了NETs與1型糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Diana J等[23]發(fā)現(xiàn)胰腺嗜中性粒細胞和β-1a細胞合作激活pDCs并啟動了1型糖尿病的發(fā)生。此外，在1型糖尿病患者的胰腺組織中發(fā)現(xiàn)有NETs存在[24]。

3 中醫(yī)藥治療自身免疫性疾病的研究概況

臨床上常用的免疫抑制藥物大多數(shù)只能改善癥狀，不能從根本上有效控制疾病的發(fā)生發(fā)展，如激素、環(huán)磷酰胺、孢菌素等，這些藥的療效雖然已被證實，但其毒副作用大，且不能長期持續(xù)應(yīng)用[25]。所以，尋找和開發(fā)高效、無毒的免疫抑制藥物，對于人類健康來說，是重中之重的任務(wù)。中藥是我國的寶貴財富，中藥不僅資源豐富，療效顯著，而且副作用小，多成分多靶點。目前，國內(nèi)外科學(xué)家和藥企均對中藥的研究有濃厚的興趣。雖然中藥的療效確切，但是其藥效物質(zhì)和作用機制尚不明確，故使它的使用和推廣受到了限制。中藥免疫抑制劑與化學(xué)藥免疫抑制劑相比，有以下特點：①成分多樣，藥理作用廣泛，如具有抗炎、抗過敏及免疫抑制和免疫雙向調(diào)節(jié)等作用；②毒性小、副作用少，雖然有部分藥有毒性，但減量或停藥后毒性和副作用即消失；③與其它免疫抑制劑合用后能明顯提高療效，降低后者的毒副作用[26]。因此，中藥作為免疫抑制劑來治療免疫性疾病，越來越受到人們的歡迎。

3.1 中藥治療RA 中醫(yī)學(xué)理論中RA屬于痹證的范疇，有骨痹、頑痹、歷節(jié)風(fēng)等稱謂。根據(jù)其病因又可分為寒痹、濕痹、熱痹等。當(dāng)人體正氣不足時，易被風(fēng)寒濕熱之邪侵犯而引起。故本病的病機為氣血陰陽臟腑虧損為本，外受風(fēng)寒濕熱之邪，邪氣稽留關(guān)節(jié)、痹阻氣血為標。如《素問·痹論》中記載：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹?！币虼酥委熒弦造铒L(fēng)除濕、行氣活血、通絡(luò)止痛為主[27]。雷公藤又名黃藤、莽草、水莽子、南蛇藤等，是衛(wèi)矛科雷公藤屬多年生植物。雷公藤具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、解毒殺蟲等功效，其性寒味苦，歸肝、腎二經(jīng)。在過往，雷公藤主要作為殺蟲藥，也用于治療關(guān)節(jié)炎、皮膚病等疾病。二十世紀六七十年代，我國醫(yī)務(wù)工作者發(fā)現(xiàn)雷公藤能抑制麻風(fēng)病的炎癥反應(yīng)并成功將雷公藤應(yīng)用于麻風(fēng)病的治療上。此后，逐步將雷公藤的運用推廣到治療

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、血管炎、腫瘤等多種疑難雜癥，均有比較獨特的效果。目前已經(jīng)從雷公藤中提取出雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤堿、雷公藤酸等100多種有效的化學(xué)成分[28～29]。臨床上雷公藤是治療RA的有效藥物，但其作用機制尚未完全闡明。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞能夠合成釋放大量炎性因子和ROS，并攻擊自身組織。中性粒細胞在炎癥部位可以抑制調(diào)亡，延長存活壽命，擴大炎癥的釋放[30]。中性粒細胞還可以形成NETs，在RA的發(fā)病中起到了重要作用。袁凱[31]通過動物實驗和體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素能明顯緩解AA小鼠關(guān)節(jié)炎的癥狀；通過對炎癥部位做了病理分析，雷公藤甲素治療組炎癥部位病理切片的炎癥程度較未治療組得到了顯著的改善，炎性細胞的浸潤顯著減少；通過免疫熒光法分析雷公藤甲素對NETs的抑制作用發(fā)現(xiàn)，采用刺激物PMA刺激后，中性粒細胞產(chǎn)生的NETs增加；而加入200 nM雷公藤甲素后，中性粒細胞產(chǎn)生的NETs減少。表明雷公藤甲素可抑制中性粒細胞NETs的形成，其可通過抑制中性粒細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來達到治療RA的目的。

3.2 中藥治療SLE 從癥狀表現(xiàn)上看，SLE屬于中醫(yī)學(xué)紅蝴蝶病、陰陽毒、熱毒斑等范疇。中醫(yī)學(xué)認為其病因不外乎內(nèi)外兩類，內(nèi)因多為先天稟賦不足、肝腎不足、陽氣虛弱等；外因多為外感熱毒、疲勞過度、七情內(nèi)傷等。內(nèi)外熱毒相結(jié)合，郁結(jié)于內(nèi)，發(fā)于外則出現(xiàn)皮膚紅斑，所以該病以熱毒蘊結(jié)為標，肝腎虧虛為本。丹參又名赤參、血丹參、紫丹參等，為唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖?！度杖A子諸家本草》載其能：“養(yǎng)神定志，通利關(guān)脈，治冷熱勞，骨節(jié)疼痛，四肢不遂，排膿痛，生肌長肉，破宿血，補新生血等”。丹參作為一味經(jīng)典的活血化瘀中藥，有“一味丹參飲，功同四物湯”之說。臨床上丹參主要用于預(yù)防和治療腦血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等危險性疾病，隨著研究的深入，丹參的其他藥理功效將進一步被開發(fā)，使其在臨床上的運用價值越來越高[32]。近年來越來越多的研究顯示，中性粒細胞在SLE的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，同時它與器官損傷之間的關(guān)系也十分密切；NETs由DNA和抗菌肽組成，形成了SLE自身抗原的主要來源，其與SLE活動、LN、低補體等均有相關(guān)性[33]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，丹參的主要活性成分丹參酮IIA，可以直接作用于中性粒細胞，使中性粒細胞呼吸爆發(fā)受到抑制以及減少氧自由基的產(chǎn)生，并且對人白細胞的游走趨化有明顯的抑制作用，且抑制作用有明顯的劑量依賴性，并且呈現(xiàn)出很好的直線相關(guān)性[34]。丹參酮IIA可以抑制炎癥反應(yīng)和減少組織損傷。近年來也有研究證實，丹參酮IIA不僅可誘導(dǎo)中性粒細胞的調(diào)亡，還可促進中性粒細胞的反向遷移，從而消除炎癥。此外，丹參酮IIA還可以阻斷體內(nèi)中性粒細胞的促炎信號。上述研究結(jié)果均提示丹參能從多條途徑調(diào)節(jié)中性粒細胞的功能。史建強等[35]采用人外周血中性粒細胞體外培養(yǎng)細胞模型進行實驗研究，檢測中性粒細胞產(chǎn)生超氧陰離子(O-2)和一氧化氮(NO)的量，還通過運用不同質(zhì)量濃度的丹參來檢測其對SLE患者外周血中性粒細胞的凋亡率及O-2和NO產(chǎn)生量的影響；結(jié)果顯示，SLE組的外周血中性粒細胞的凋亡率及產(chǎn)生的O-2和NO較正常組均明顯升高；在體外丹參明顯抑制SLE患者中性粒細胞的凋亡，同時丹參還可抑制SLE患者中性粒細胞釋放0-2、合成NO。上述研究結(jié)果表明了丹參對SLE患者體外中性粒細胞的凋亡及其產(chǎn)生0-2和NO等活性介質(zhì)有一定調(diào)節(jié)作用。但是丹參酮IIA是否通過調(diào)節(jié)中性粒細胞的功能達到治療SLE的目的，目前尚缺乏研究。

3.3 中藥治療DM 中醫(yī)學(xué)認為，DM屬于消渴的范疇，主要病機以陰虛為本，燥熱為標。臨床上以煩渴多飲、消谷善饑、形體羸瘦、或尿有甜味為主要癥狀。姜黃有破血行氣、通經(jīng)止痛的功效，常用于治療胸脅刺痛、風(fēng)濕肩臂疼痛、跌打腫痛、閉經(jīng)、癥瘕等多種病癥。姜黃的化學(xué)成分主要是姜黃素類和姜黃揮發(fā)油，姜黃素類主要包括姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素。其中，姜黃素是姜黃發(fā)揮藥理作用最重要的化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護肝腎功能等多種作用[36]。有研究表明，姜黃素對DM大鼠及其并發(fā)癥可能具有較好的防治作用[37]。DM患者感染類鼻疽假單胞菌后，患者檢測NETs的生成量減少，一定程度上對DM患者容易感染病原體的原因做出解釋[38]。Wong SL等[39]研究發(fā)現(xiàn)，DM患者體內(nèi)的中性粒細胞容易自發(fā)或是因機體離子紊亂產(chǎn)生NETs，在DM患者體內(nèi)提取的中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)PAD4的表達量增加，而PAD4是染色質(zhì)解旋的重要物質(zhì)，也是NETs的第一步，從一定程度上說明NETs參與了DM的發(fā)生發(fā)展。由于DM患者的糖代謝發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致機體葡萄糖自身氧化、蛋白非酶糖化、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活及代謝應(yīng)激等，使機體產(chǎn)生大量的活性氧；同時，由于抗氧化酶發(fā)生糖化或氧化，機體抗氧化酶活性和清除自由基的能力均下降，而脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物丙二醛(MDA)等反映氧化應(yīng)激水平的物質(zhì)的含量明顯升高。故DM發(fā)生發(fā)展時，機體氧化應(yīng)激水平明顯升高。于冬青等[40]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素治療組大鼠的血清SOD和CAT活性與DM組大鼠相比明顯升高，而MDA的含量明顯下降，表明姜黃素能增加DM大鼠的抗氧化酶活性及有效地清除自由基和減輕脂質(zhì)過氧化，對DM及其慢性并發(fā)癥可能具有較好的防治作用。但是姜黃素是否通過調(diào)節(jié)中性粒細胞的功能達到治療DM的目的，目前尚缺乏研究。

4 討論

AID的形成是一個非常復(fù)雜的過程，其發(fā)生的基本機制是免疫系統(tǒng)對自身組織失去耐受性，即免疫耐受的缺失。自身免疫反應(yīng)不僅能導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生，而且由于其本身存在性循環(huán)，使得疾病久治不愈，預(yù)后不良[41]。

自2004年發(fā)現(xiàn)并命名NETs至今，已經(jīng)證實NETs具有強大的抗菌作用，其作為一種全新的機體防御形式，在多種疾病中發(fā)揮著重要作用。NETs中所含的多種自身抗原和修飾酶，可導(dǎo)致多種自身免疫病的發(fā)生，自身抗體與NETs及組織可形成免疫復(fù)合體并在組織的損傷中扮演著重要角色。不過，事物總是有兩面性的，雖然NETs的產(chǎn)生對于機體具有一定的保護作用，但隨著NETs的產(chǎn)生，機體患病的幾率也大大增加[42]。因此國內(nèi)外學(xué)者對其進行大量研究以期望能更好地認識NETs對人體疾病形成過程中所發(fā)揮的作用，為開發(fā)藥物和改善治療措施提供有價值的參考依據(jù)。

中藥免疫抑制劑因其藥理作用廣泛和副作用小等優(yōu)點，在臨床上越來越多的被應(yīng)用于治療自身免疫性疾病。但大多數(shù)中藥免疫抑制劑存在如缺乏特異性和選擇性，可能會導(dǎo)致正常的和病理的免疫應(yīng)答過程同時受到影響，免疫抑制作用對初次的較對再次的免疫應(yīng)答反應(yīng)要強等缺陷[43]。此外，中藥免疫抑制作用研究方面還存在著很多問題，如：①可供研究的樣品大多是粗提物，在分子水平上難以闡明它們的構(gòu)效關(guān)系、藥理作用和機制；②缺乏橫向比較性研究，即在同一實驗條件下同一水平上，對不同中藥及其成分進行比較性的免疫藥理研究；③現(xiàn)今雖然有不少中藥免疫調(diào)節(jié)劑在國內(nèi)已應(yīng)用于臨床，但它們的化學(xué)成分組成和結(jié)構(gòu)尚不明確，且質(zhì)量難以控制，藥效的重復(fù)性差，所以不符合國際規(guī)范，難以進入國際市場[44]。因此，今后應(yīng)該加強對具有免疫抑制作用的中藥進行免疫抑制活性成分系統(tǒng)篩選，并對其化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性成分的作用和機制進行深入研究，從細胞水平、分子水平或基因水平上揭示中藥藥理作用。

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