覃虹錕，桂艷萍，王亞菁，趙 麗*

(中國藥科大學 1江蘇省腫瘤發(fā)生與干預重點實驗室；2天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室；3基礎醫(yī)學與臨床藥學學院生理學教研室，南京 210009)

膠質瘤是一種常見的中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤。在我國每年大約有10萬人被確診為膠質瘤，超過6萬人因膠質瘤死亡，膠質瘤防治工作形勢嚴峻[1]。目前膠質瘤的臨床治療以手術、化療和放療聯(lián)合治療為主；盡管如此，患者的無進展生存期約為5～7個月，中位生存期也僅停留在12～14個月，5年生存率低至3%～5%[2]。

替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是我國治療膠質瘤的一線用藥，單用或與放療聯(lián)用治療新診斷的神經膠質瘤[3]，其能透過血-腦脊液屏障到達病灶，并通過烷化DNA起到抗腫瘤作用[4]。替莫唑胺的應用顯著提高了膠質瘤患者的無進展生存期和總生存期，然而臨床數據顯示，僅有45%的患者對替莫唑胺產生響應，且隨著用藥時間推移，響應率逐步降低，患者出現(xiàn)耐藥[5]。為了提高替莫唑胺的療效，各國學者對其耐藥機制進行了深入探究，以求延長患者生命。

Cx43是中樞神經系統(tǒng)中表達最豐富的間隙連接蛋白[6]，其與膠質瘤的惡性生物學行為有著密切聯(lián)系[7]，近年來的研究表明Cx43可能是影響替莫唑胺療效的原因之一。本文主要對Cx43與膠質瘤替莫唑胺耐藥的關系的研究進行總結，以期為提高替莫唑胺療效提供理論參考和依據。

1 間隙連接與Cx43

間隙連接是哺乳動物細胞間進行物質交換和信號傳遞的重要通道。6個相同的間隙連接蛋白排列形成中心孔徑為2～4 nm的連接子形成半通道，可與相鄰細胞的細胞膜上的半通道組成通道[8]。離子(Na+、K+、Ca2+、Cl-)，第二信使[環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸尿苷(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)]，小分子代謝物(葡萄糖、氨基酸)和microRNA等物質可通過間隙連接在細胞間傳遞，從而保證細胞間電耦合或生化耦合以維持細胞穩(wěn)態(tài)[7]。人類基因組中有21種連接蛋白編碼基因[9]，其中由GJA1基因編碼的Cx43是人體組織中表達最豐富的間隙連接蛋白。Cx43的肽鏈由N末端、2個胞外環(huán)、4個跨膜區(qū)域、1個胞內環(huán)及C末端組成[10]，其中2個胞外環(huán)和C末端是Cx43發(fā)揮功能的主要區(qū)域，決定著間隙連接通道的形成及其功能(圖1)[11]。

Cx43在膠質瘤發(fā)生、惡性增殖、侵襲以及耐藥中起重要作用[12-15]。Crespin等[16]對85例膠質母細胞瘤手術樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)約60%的膠質瘤樣本存在Cx43蛋白高表達，且表達與膠質瘤惡性程度呈正相關。但是，Caltabiano等[17]對32例星形膠質細胞瘤樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)Cx43蛋白表達與惡性程度呈負相關。通過對腫瘤和腫瘤基因圖譜(Cancer Genome Atlas,TCGA)和R2 database的數據進行分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)膠質瘤組織中的GJA1 mRNA表達顯著高于正常腦組織，且高表達GJA1的膠質瘤患者總生存期顯著低于低表達患者。Cx43在膠質瘤中表達差異較大，這可能和膠質瘤發(fā)展過程及其所處的微環(huán)境密切相關。

Figure1 Schematic of Connexin 43 (Cx43)

2 替莫唑胺耐藥的分子機制

替莫唑胺作為一種能透過血-腦脊液屏障的烷化劑，通過烷基化DNA分子上鳥嘌呤第6位氧原子上和第7位氮原子發(fā)揮細胞毒作用，誘導膠質瘤細胞凋亡[18]。

2.1 DNA損傷修復

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)介導的DNA損傷修復是膠質瘤患者出現(xiàn)替莫唑胺耐藥的最主要原因。MGMT通過不可逆地將烷化基團從O6-甲基鳥嘌呤(O6-MeG)殘基轉移到MGMT 蛋白145位的半胱氨酸殘基以修復替莫唑胺帶來的DNA損傷[19]。近年來，研究者通過甲基化特異性PCR技術發(fā)現(xiàn)膠質瘤級別與MGMT啟動子甲基化程度呈顯著負相關，與MGMT蛋白表達呈正相關，且在膠質瘤細胞中沉默MGMT基因能顯著提高替莫唑胺治療效果[18,20-21]。Hirohata等[22]通過分析膠質瘤手術樣本發(fā)現(xiàn)錯配修復蛋白6(mismatch repair protein，MSH6)也能修復替莫唑胺造成的DNA損傷，降低替莫唑胺藥效。隨著研究的深入，MutL homolog 3(MLH3)、ERCC家族和XRCC家族等DNA損傷修復蛋白在化療耐藥中的作用也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，可能成為逆轉替莫唑胺耐藥的靶點[23-25]。

Figure2 Relative expression of gap junction protein,alpha-1 (GJA1) in glioblastoma multiforme (GBM) and normal brain (left).Pateint data was retrieved from Cancer Genome Atlas (TCGA).Kaplan-Meier overall survival analyses of GJA1 low (red) and GJA1 high (blue) glioma patients.The survival time of glioma patients (x-axis) is defined as months after diagnosis(right).Pateint data was retrieved from the R2 database

2.2 ATP結合盒轉運蛋白外排

膠質瘤細胞內替莫唑胺的藥物濃度取決于細胞對于藥物的攝取和外排。替莫唑胺是一種親脂性分子，可以通過主動運輸攝入細胞內，但是細胞膜上的轉運蛋白可通過外排作用降低細胞內替莫唑胺濃度，其中ATP結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette，ABC)家族發(fā)揮重要作用[26]。P-糖蛋白(P glycoprotein,P-gp)是一種由MDR1基因編碼的ATP依賴型排出性膜轉運蛋白。通過對112例手術樣本進行分析，Schaich等[27]發(fā)現(xiàn)MDR1基因表達水平高的膠質瘤患者對替莫唑胺響應率較低，預后差。Munoz等[28]用P-gp抑制劑聯(lián)合替莫唑胺對膠質瘤細胞進行處理，相比替莫唑胺單用組，聯(lián)合用藥組細胞內Caspase-3蛋白表達增加，凋亡增加。除P-gp外，多藥耐藥相關蛋白(MRP)、肺癌耐藥性相關蛋白(lung resistance related protein,LRP)和ABCG2(ATP-binding Cassette Sub-family G Member 2)等外排蛋白在膠質瘤中表達均有增加，和替莫唑胺耐藥密切相關[29-31]。

2.3 膠質瘤細胞自噬

自噬是細胞遇到缺氧、輻射、饑餓或DNA損傷等情況下采取的一種自我保護機制，其通過形成自噬體包裹目標細胞器或胞質內的大分子物質，再由自噬體與溶酶體結合降解這些細胞中多余的或已失去功能的內容物，以維持細胞穩(wěn)態(tài)[32-33]。近年來研究表明，治療劑量(每日75 mg/m2)下替莫唑胺能導致O6-MeG損傷并誘導膠質瘤細胞產生自噬，引起替莫唑胺耐藥[34]。對于不可手術切除的膠質瘤患者，臨床多采用放療聯(lián)合替莫唑胺化療的方式進行治療[4]，放療作為一種強大的DNA損傷途徑能引發(fā)膠質瘤細胞產生自噬[35]，這種自噬也可能是導致替莫唑胺耐藥的一大原因。在體內外實驗中，通過使用氯喹(chloroquine)等自噬抑制劑均能顯著增強替莫唑胺對膠質瘤的凋亡作用[36-38]。截至2018年9月，已有2項氯喹聯(lián)合替莫唑胺的治療方案分別進入Ⅰ期臨床(NCT02378532)和Ⅲ期(NCT03243461)臨床試驗階段[39-40]。

3 Cx43介導膠質瘤替莫唑胺耐藥的研究

膠質瘤對替莫唑胺耐藥不僅是單個細胞的生物學行為，還需將腫瘤細胞置于所處的微環(huán)境中，考慮腫瘤細胞之間的相互作用，甚至腫瘤細胞和周圍基質細胞之間的相互作用。

3.1 膠質瘤細胞間Cx43介導替莫唑胺耐藥

Cx43作為細胞膜上的通道蛋白，大量研究表明其表達或功能異常可能是導致替莫唑胺耐藥的重要原因。在LN229膠質瘤細胞中過表達Cx43能顯著降低Bax/Bcl-2蛋白的比例，并減少線粒體細胞色素C的釋放，導致替莫唑胺耐藥[15,41]。Munoz 等[42]隨后發(fā)現(xiàn)，經替莫唑胺長期處理后的U87膠質瘤細胞Cx43表達上調，并通過EGFR1-JNK-ERK-AP1軸形成耐藥性，敲除Cx43后，替莫唑胺誘導的凋亡顯著增加。Beahm等[43]通過構建Cx43 C末端截短突變，發(fā)現(xiàn)可以通過減弱Cx43與ZO-1、PKC和β-catenin等蛋白相互作用影響其通道與非通道功能；將Cx43第154位蘇氨酸定點突變?yōu)楸彼?T154A)，可以使相鄰細胞間形成正常間隙連接通道，但不具備胞間通訊功能[44]；在此基礎上，Gielen等[15]發(fā)現(xiàn)完整的Cx43 C末端結構和Cx43介導的細胞間通訊是其導致膠質瘤替莫唑胺耐藥的重要因素。同樣，使用間隙連接抑制劑甘珀酸(carbenoxolone,CBX)后在體內外都顯著增強了替莫唑胺的藥效[45-46]。為了研究Cx43與MGMT的關系，Lai等[47]通過體外誘導膠質瘤替莫唑胺耐藥細胞發(fā)現(xiàn)其Cx43和MGMT的表達均顯著增加。但也有研究指出在MGMT缺失的膠質瘤細胞中，高表達Cx43的細胞可通過激活AKT-AMPK-mTOR通路降低對替莫唑胺敏感性[48]。綜上所述，Cx43介導的膠質瘤替莫唑胺耐藥可能不是依賴MGMT的，而可能與其形成的間隙連接通道和C末端活性形式相關。

3.2 膠質瘤與周圍細胞間Cx43介導替莫唑胺耐藥

在膠質瘤微環(huán)境中存在著大量的基質細胞，包括膠質細胞、神經元細胞、內皮細胞及免疫細胞等多種細胞[49]。膠質瘤與周圍細胞間基于Cx43形成的間隙連接可能也是影響膠質瘤替莫唑胺耐藥的原因。

腦組織中膠質細胞分布最廣，約占人腦體積的50%，其中星形膠質細胞又是膠質細胞中比例最大的細胞[50]。星形膠質細胞在維持中樞神經系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，參與形成血-腦脊液屏障，可通過調節(jié)鈣濃度和釋放膠質遞質調節(jié)腦部血流及神經元之間的物質代謝，參與了神經循環(huán)的形成[51-53]。星形膠質細胞在腦部損傷、缺血、感染和腫瘤等作用下能被活化，以保護正常腦組織[54-55]。星形膠質細胞通過旁分泌和間隙連接作用上調黑色素瘤和乳腺癌的腦轉移瘤細胞的生存基因，并提高腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[6,56-58]。在膠質瘤微環(huán)境中，腫瘤周圍的星形膠質細胞被激活，Cx43表達上調[13]。在體外將星形膠質細胞與膠質瘤細胞共培養(yǎng)模擬膠質瘤微環(huán)境，Yang等[59]發(fā)現(xiàn)膠質瘤對替莫唑胺敏感性降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)Cx43介導的間隙連接降低了膠質瘤對替莫唑胺的敏感性，給予CBX后膠質瘤恢復對替莫唑胺的敏感性，同時RNA微陣列分析的結果顯示，共培養(yǎng)后膠質瘤與星形膠質細胞形成間隙連接，導致其中一些耐藥基因上調，抗凋亡基因下調[60]。膠質瘤細胞中Ca2+濃度也是影響其耐藥的重要原因[61]，星形膠質細胞通過與膠質瘤形成間隙連接，降低膠質瘤中Ca2+濃度，減少替莫唑胺引起的凋亡[62]。此外，microRNA也可通過間隙連接通道在星形膠質細胞和膠質瘤細胞間傳遞[63]，這可能也是影響膠質瘤耐藥的重要原因。

除星形膠質細胞外，小膠質細胞和免疫細胞等與膠質瘤通過間隙連接相互作用的現(xiàn)象也逐漸被揭示[64-67]，但少有關于替莫唑胺耐藥的研究，周圍細胞介導膠質瘤替莫唑胺耐藥的分子機制還需進一步研究。

4 以Cx43為靶點的抗腫瘤候選化合物

Cx43在膠質瘤替莫唑胺耐藥中發(fā)揮重要作用，但從治療的角度來看，因其在全身表達，同時也是膠質細胞轉運代謝廢物、傳遞信號，確保心臟細胞收縮同步的重要蛋白，使其成為一個極有挑戰(zhàn)性的藥理靶點。CBX是目前研究中使用較多的間隙連接抑制劑，但由于其不能透過血-腦脊液屏障[68]，限制了其在臨床上的使用。隨著藥物研究的深入，發(fā)現(xiàn)了一些臨床使用的藥物能透過血-腦脊液屏障并有一定的間隙連接抑制作用，如托那博沙(tonabersat)、甲氯滅酸鈉(meclofenamate)等，動物體內實驗結果也顯示這些藥物能顯著增強化療藥物的治療效果[6]，這也為老藥新用提供了研究思路。近年來，Cx43的結構逐漸被解析出來，一些特異性作用于Cx43蛋白結構的抑制劑逐漸被發(fā)現(xiàn)。研究人員用聚乙二醇化脂質體包裝重組單抗作用于Cx43的胞外域，發(fā)現(xiàn)其在動物體內實驗中抑制了膠質瘤生長[69-70]。Cx43的C末端也是其發(fā)揮功能的重要區(qū)域，可與c-Src、PKC、AKT和AMPK等信號分子相互作用[71]，調節(jié)其通道功能和亞細胞定位等，并引發(fā)替莫唑胺耐藥[72]，運用αCT1肽模擬Cx43的C末端在體內外均能顯著提高膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性[48]。Cx43的胞內環(huán)也與其通道功能密切相關，運用L2和Gap19等模擬肽均能抑制其通道活性并減少膠質瘤與星形膠質細胞間的物質交換[73-74]。此外，許多天然藥物也能非特異性的調節(jié)間隙連接，可抑制腫瘤細胞增殖并增強抗腫瘤藥物的活性，如表1所示。天然藥物以其不良反應小的特點著稱，若對其結構進行改造增強其透過血-腦脊液屏障能力、改善腦部分布，天然藥物有望成為一類逆轉膠質瘤替莫唑胺耐藥的重要藥物。

Table1 Natural anti-tumor compounds targeting Cx43

NameTumorReferenceTotal Flavonoids of Litsea core-anaTesticular cancer[75]TretinoinProstate cancer[76]BaicaleinCervical cancer[77]QuercetinBreast cancer[78]QuinolinesBreast cancer[79]

5 總 結

近年來膠質瘤替莫唑胺耐藥的研究有了很大進展，而其中Cx43介導耐藥的作用也逐漸被揭示。但膠質瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤微環(huán)境的復雜性，使耐藥性的發(fā)生并不僅受某種單一因素調控，具體的發(fā)生機制還需要進一步深入研究，如小膠質或腫瘤相關巨噬細胞通過間隙連接通道與膠質瘤相互作用介導耐藥的機制以及以Cx43為靶點的藥物研究和優(yōu)化等，這些成果有望為膠質瘤臨床治療提供新的理論依據以及候選治療藥物。