葉 峰，呂青林，祝婉芳，馮 鋒,2，張 杰*

(1中國藥科大學中藥學院,南京210009；2江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院,淮安223003)

黑色素是由動物黑色素細胞合成，可以吸收紫外線而保護皮膚免受紫外線的傷害，紫外線的照射會加速黑色素的合成。目前，美白逐漸成為人們審美的標準，消費者越來越青睞天然溫和無刺激、安全有效的美白產(chǎn)品，而市場上主要的美白產(chǎn)品為色素合成的抑制劑例如熊果苷、曲酸等[1]，但曲酸會引發(fā)腫瘤，熊果苷對黑色素的抑制受濃度限制，即在某個合適濃度下其抑制黑色素的合成，該濃度外則會增加黑色素的含量[2-3]。因此，尋找新型的美白劑仍具有重要的意義。

Anisopusmannii為蘿藦科(Asclepiadaceae)植物，其主要分布于非洲，在尼日利亞北部，它作為具有傳統(tǒng)的藥用功效而被人們熟知，其藥用價值主要集中于糖尿病、腹瀉等。在喀麥隆，因其具有魚毒性而被用來當捕魚的誘餌[4]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，其具有抗氧化[5]、抗炎鎮(zhèn)痛[6]、降血糖[7]和抑制病原微生物[8]等活性，而關(guān)于Anisopusmannii的成分研究較少，目前從Anisopusmannii中分離得到的成分主要有生物堿類、萜類[9]等，從已分離得到的化合物和本文中分離得到化合物中大部分均為含有醇羥基或酚羥基的結(jié)構(gòu)，結(jié)合本課題組前期針對抑制黑色素生成活性研究基礎[10-12]，發(fā)現(xiàn)化合物結(jié)構(gòu)中含有醇羥基或酚羥基結(jié)構(gòu)時，多數(shù)會顯示有較強的抑制黑色素生成活性。本研究采用硅膠、ODS和大孔樹脂等柱色譜分離方法和NMR、MS等手段對該植物干燥葉的化學成分進行研究，并且探索了其抑制黑色素分泌的活性，對該植物進一步的藥效物質(zhì)基礎的研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 材料與試劑

Anisopusmannii植物由Dr.Zaruwa Zira Moses(Adamawa state university)于尼日利亞采集所得。小鼠黑色素瘤細胞(B16)購自日本Riken細胞庫，其他所有試劑均符合相應儀器或?qū)嶒炓蟆?/p>

1.2 儀 器

核磁共振波譜儀(德國Bruker公司400 MHz儀器，以TMS為內(nèi)標)；高分辨質(zhì)譜儀(Agilent 1100 series LC-MS)；分析型高效液相(Shimadzu LC-20AT系列)；分析柱(Shimadzu VP-ODS,250 mm×4.6 mm)；CAX-370型離心機(日本Tomy Seiko公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；XD-101型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；XD-202型倒置顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)。

2 提取和分離

Anisopusmannii的干燥葉用MeOH加熱回流得總浸膏48.5 g，H2O和EtOAc分別萃取,EtOAc層浸膏用n-Hexane和MeOH-H2O(8∶2)分別萃取得n-Hexane層萃取部位5.0 g，MeOH-H2O萃取部位17.3 g，H2O層用n-BuOH萃取得n-BuOH萃取部位8.3 g，H2O層14.9 g。

n-Hexane部位：用硅膠(50.0 g)柱色譜方法分離，Hexane/EtOAc(1∶0→0∶1)洗脫得到5個洗脫組分(HFr.1～HFr.5)。HFr.2(Hexane-EtOAc,9∶1洗脫所得)用硅膠(17.5 g)柱色譜方法分離，Hexane-EtOAc(1∶0→0∶1)洗脫得到6個洗脫組分(HFr.2-1～HFr.2-6)，通過RP-HPLC分離HFr.2-2(Hexane-EtOAc，9.5∶0.5洗脫所得)得到化合物1(1.9 mg)；HFr.3(Hexane-EtOAc，7∶3洗脫所得)用硅膠(50.5 g)柱色譜方法分離，Hexane-EtOAc(1∶0→0∶1)洗脫得到8個洗脫組分(HFr.3-1～HFr.3-8)，繼續(xù)用硅膠(5 g)對HFr.3-2(Hexane-EtOAc，9∶1洗脫所得)進行柱色譜分離，Hexane-EtOAc(1∶0→0∶1)洗脫得到5個洗脫組分(HFr.3-2-1～HFr.3-2-5),通過RP-HPLC分離HFr.3-2-3(Hexane-EtOAc,8.5∶1.5洗脫所得)得到化合物2(4.2 mg)。

MeOH-H2O部位：用DIAION HP-20(600.0 g)柱色譜方法分離，H2O-MeOH(1∶0→1∶9)洗脫得到6個洗脫組分(MFr.1～MFr.6)，繼續(xù)用硅膠(50.0 g)對MHFr.4(H2O-MeOH,5∶5)洗脫所得)進行柱色譜分離，CHCl3-MeOH(1∶0→0∶1)洗脫得到15個洗脫組分(MHFr.4-1～MHFr.4-15)，繼續(xù)用ODS(4.5 g)對MHFr.4-6(CHCl3-MeOH，8∶2洗脫所得)進行柱色譜分離，H2O-MeOH(9∶1→7∶3)洗脫得到兩個組分(MHFr.4-6-1～MHFr.4-6-2)，通過RP-HPLC分離MHFr.4-6-2得到化合物3(3.2 mg)；MHFr.4-8(CHCl3-MeOH，8∶2洗脫所得)用硅膠(22.3 g)進行柱色譜分離，CHCl3-MeOH(1∶0→0∶1)洗脫得到6個組分(MHFr.4-8-1～MHFr.4-8-6)，繼續(xù)用ODS(1.1 g)對MHFr.4-8-4(CHCl3-MeOH，8.5∶1.5洗脫所得)進行柱色譜分離后，通過RP-HPLC分離MHFr.4-8-4-2組分得到化合物4(4.3 mg)；MHFr.6(H2O-MeOH，1∶9)用硅膠(200.0 g)進行柱色譜分離，CHCl3-MeOH(1∶0→0∶1)洗脫得到9個組分(MHFr.6-1～MHFr.6-9)，通過RP-HPLC對MHFr.6-6(CHCl3-MeOH，7∶3洗脫所得)組分進行分離得到化合物5(4.3 mg)；n-BuOH部位：用硅膠(450.0 g)柱色譜方法分離，CHCl3-MeOH(1∶0→0∶1)洗脫得到9個組分(BuFr.1～BuFr.9)，繼續(xù)用硅膠(130.0 g)對BuFr.1(CHCl3/MeOH 1∶0洗脫所得)進行柱色譜分離，CHCl3-MeOH，4∶6→CHCl3-MeOH，0∶1洗脫得到8個組分(BuFr.1-1～ BuFr.1-8)，通過RP-HPLC分離BuFr.1-5(CHCl3-MeOH，5∶5 洗脫所得)得到化合物6(92.6 mg)；BuFr.7(CHCl3-MeOH，3∶7洗脫所得)用Sephadex LH-20(5.0 g)進行柱色譜分離，H2O-MeOH(1∶0→0∶1)洗脫得到9個組分(BuFr.7-1～BuFr.7-9)，繼續(xù)用硅膠(28.0 g)對BuFr.7-6組分進行柱色譜分離，CHCl3-MeOH(9∶1→1∶9)洗脫得到6個組分(BuFr.7-6-1～ BuFr.7-6-6)，對BuFr.7-6-4采用硅膠柱色譜進一步分離，通過RP-HPLC分離得到化合物7(5.4 mg)。

Figure1 Structures of compounds1-7from the leaves ofAnisopusmannii

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色油狀，5%硫酸乙醇加熱顯紫紅色。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δH:0.76(1H,dd,J=5.8,10.8 Hz,C5-H),0.82～1.66(m),1.83(m),2.33(1H,dd,J=5.6,11.1 Hz,C19-H),4.44(1H,dd,J=5.8,10.8 Hz,C3-H),4.66(2H,br.s,C29-H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC:14.5(C-27),17.9(C-28),18.1(C-6),19.0(C-30),20.9(C-10),23.7(C-1),25.0(C-11),27.4(C-14),35.5(C-15),37.0(C-9),37.7(C-2),38.0(C-12),42.8(C-13),50.3(C-8),55.3(C-4),80.9(C-3),109.3(C-29),150.9(C-20)。HR-ESI-MS Calcd.for C32H52O2[M+H]+:469.396 6；Found:469.397 2。與文獻[13]對照，鑒定化合物1為3β-acetoxylup-20(29)-ene。

化合物2淡黃色油狀，5%硫酸乙醇加熱顯黃色。1H NMR(CD3OD,400 MHz)δH:0.9(6H,d,J=13.7 Hz,C1-C(CH3)2),1.3(s),2.2(3H,d,J=15.1 Hz,CH3CO),5.3(1H,s,C2-H)。HR-ESI-MS Calcd.for C18H34O2[M+H]+:283.259 2；Found:283.258 0。與文獻[14]對照，鑒定化合物2為1-acetoxy-2-isopropyl-1-tridecene。

化合物3黃色固體結(jié)晶，mp：176～177 ℃。1H NMR(CD3OD,400 MHz)δH:1.00(3H,d,J=6.2 Hz,C6?-H),3.09(2H,m,C4″-H),3.28(1H,m,C5″-H),3.29(2H,m,C6″-H),4.39(1H,s,C1?-H),5.09(1H,d,J=7.1 Hz,C1″-H),6.19(1H,d,J=2.1 Hz,C6-H),6.38(1H,d,J=2.1 Hz,C8-H),6.86(1H,d,J=8.5 Hz,C5′-H),7.64(1H,dd,J=2.1,8.5 Hz,C6′-H),7.76(1H,d,J=2.1 Hz,C2′-H)。HR-ESI-MS Calcd.for C27H30O16[M+H]+:611.156 5；Found:611.157 0。與文獻[15]對照，鑒定化合物3為rutin。

化合物45%硫酸乙醇加熱顯黃色，1H NMR(CD3OD,400 MHz)δH:3.72(3H,s,OCH3),3.73(3H,s,OCH3),4.43(1H,dd,J=6.87,6.87 Hz,C3′-H),4.45(2H,dd,J=2.3,9.6 Hz,C6′-H),4.72(1H,dd,C4-H),6.02(1H,d,J=15.6 Hz,C3-H),6.13(1H,d,J=1.96 Hz,C1′-H),6.62(1H,d,J=8.7 Hz,C8″-H),6.86(1H,d,J=8.7 Hz,C8?-H),7.10(1H,d,J=8.7 Hz,C7″-H),8.09(1H,d,J=8.7 Hz,C7?-H)。HR-ESI-MS Calcd.for C31H36O16[M+H]+:665.203 3；Found:665.205 8。與文獻[16]對照，鑒定化合物4為3,6′-diferuloylsucrose。

化合物5白色晶體，mp：221～222 ℃。5%硫酸乙醇加熱顯紫色，1H NMR(CD3OD,400 MHz)δH:0.76(1H,m,C5-H),0.79(3H,s,C26-H),0.84(3H,s,C24-H),0.90(3H,s,C29-H),0.93(3H,s,C30-H),0.95(3H,s,C25-H),0.98(2H,m,C1-H),1.02(2H,m,C2-H),1.04(3H,s,C23-H),1,15(3H,s,C27-H),1,21(2H,m,C21-H),1.25(3H,d,J=6.6 Hz,C6?-H),1.31(2H,s,C19-H),1.46(2H,m,C22-H),1.55(2H,m,C6-H),1.57(1H.m,C9-H),1.65(2H,m,C7-H),1.68(2H,m,C15-H),2.81(1H,dd,J=3.0,14.0 Hz,C18-H),3.17(1H,dd,J=4.5,12.0 Hz,C3-H),3.19(1H,dd,J=7.6,9.0 Hz,C2′-H),3.24(1H,m,C5′-H),3.29(1H,t,J=9.0 Hz,C4′-H),3.32(1H,m,C5″-H),3.34(1H,t,J=9.0 Hz,C3′-H),3.38(1H,t,J=8.5 Hz,C4?-H),3.39(1H,t,J=9.0 Hz,C4′-H),3.55(1H,dd,J=7.5,9.0 Hz,C2″-H),3.66(1H,dd,J=4.5,12.0 Hz,C6″-H),3.68(1H,dd,J=4.0,12.0 Hz,C6′-H),3.75(1H,m,C5?-H)3.79(1H,dd,J=3.5,12.0 Hz,C6″-H),3.84(1H,dd,J=2.5,12.0 Hz,C6′-H),3.93(1H,dd,J=1.5,2.0 Hz,C2?-H),4.31(1H,d,J=7.6 Hz,C1′-H),5.25(1H,t,C12-H),5.37(1H,d,J=1.5 Hz,C1?-H),5.44(1H,d,J=7.6 Hz,C1″-H)。13C NMR(CD3OD,100 MHz)δC:15.3(C-25),16.1(C-26),16.8(C-24),17.9(C-6?),18.4(C-6),22.6(C-11),23.2(C-16),23.3(C-30),25.1(C-15),25.6(C-27),27.8(C-23),28.8(C-2),30.7(C-20),31.9(C-7),32.8(C-29),33.2(C-22),34.0(C-21),37.3(C-10),39.1(C-1),39.5(C-4),40.2(C-8),41.8(C-18),42.2(C-14),46.5(C-19),47.3(C-17),48.4(C-9),56.3(C-5),61.8(C-6′),62.3(C-6″),69.8(C-5?),70.6(C-4″),71.5(C-2?),71.6(C-3?),73.3(C-4?),75.3(C-2′),76.8(C-5′),77.4(C-3′),77.9(C-5″),78.1(C-3″),78.8(C-2″),90.1(C-3),94.8(C-1″),101.6(C-1?),105.8(C-1′),122.9(C-12),144.9(C-13),177.8(C-28)。HR-ESI-MS Calcd.for C49H80O16[M+H]+:925.547 5；Found:925.548 2。與文獻[17]對照，鑒定化合物5為3-O-β-D-glucopyranosyl-3-β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid 28-O-[α-L-rhamno- pyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]ester。

化合物6白色針狀結(jié)晶，5%硫酸乙醇加熱顯黃色，mp：147～148 ℃。1H NMR(CD3OD,400 MHz)δH:3.64(1H,d,J=4.6 Hz,C1-H),3.99(1H,d,J=4.1 Hz,C6-H),5.56(1H,d,J=1.2 Hz,C2-H)。13C NMR(CD3OD,100 MHz)δC:70.6(C-1),74.2(C-6),130.7(C-2).HR-ESI-MS Calcd.for C6H10O4Na[M+Na]+:169.047 6；Found:169.045 1。與文獻[18]對照，鑒定化合物6為conduritol A。

化合物7白色無定形粉末，5%硫酸乙醇加熱顯紫黑色。1H NMR(CD3OD,400 MHz)δH:1.19(3H,s,C19-H),1.23(3H,s,C18-H),1.89(1H,d,J=11 Hz,C9-H),1.99(3H,s,C11-CH3CO),2.09(3H,s,C12-CH3CO),2.20(3H,s,C21-H),2.90(1H,dd,J=5,9 Hz,C17-H),3.42(1H,m,C3-H),5.32(1H,m,C6-H),5.69(1H,d,J=11 Hz,C11-H) Cym:1.55(3H,d,J=6 Hz,C6-H),1.90(1H,m,C2-H),2.31(1H,m,C2-H),3.58(1H,dd,J=2,9 Hz,C4-H),4.07(1H,q,J=3 Hz,C3-H),4.15(1H,m,C5-H),5.82(1H,br.d,J=10 Hz,C1-H),Cym:1.37(3H,d,J=6 Hz,C6-H),1.79(1H,m,C2-H),2.28(1H,m,C2-H),3.42(1H,dd,J=2,9 Hz,C4-H),3.99(1H,q,J=3 Hz,C3-H),4.14(1H,m,C5-H),5.09(1H,dd,J=2,9 Hz,C1-H),Ole:1.63(3H,d,J=6 Hz,C6-H),1.72(1H,m,C2-H),2.47(1H,m,C2-H),3.50(1H,C3-H),3.52(1H,C5-H),3.60(1H,t,J=9 Hz,C4-H),4.67(1H,dd,J=2,9 Hz,C1-H),Alm:1.55(3H,d,J=6 Hz,C6-H),3.58(1H,dd,J=3,8 Hz,C4-H),3.87(2H,br d,J=8 Hz,C2-H),4.07(1H,t,J=3 Hz,C3-H),4.15(1H,m,C5-H),5.28(1H,d,J=8 Hz,C1-H)。13C NMR(CD3OD,100 MHz)δC:13.4(C-18),18.3(C-19),20.8(12-CH3CO),21.6(11-CH3CO),24.9(C-16),31.7(C-21),31.9(C-2),35.9(C-7),37.4(C-15),39.7(C-10),41.2(C-1),43.3(C-4),49.7(C-9),56.0(C-13),60.0(C-17),72.6(C-3),76.5(C-8),79.1(C-12),86.2(C-14),118.8(C-6),140.9(C-5),171.5(11-CH3CO),172.6(12-CH3CO),216.4(C-20),Cym:18.5(C-6),37.2(C-2),68.9(C-5),78.0(C-3),83.3(C-4),96.2(C-1),Cym:18.4(C-6),37.0(C-2),68.8(C-5),77.6(C-3),83.1(C-4),100.4(C-1),Ole:18.8(C-6),37.5(C-2),72.0(C-5),79.2(C-3),82.7(C-4),101.8(C-1),Alm:18.5(C-6),71.0(C-5),73.2(C-2),74.5(C-4),83.9(C-3),101.9(C-1)。HR-ESI-MS Calcd.for C53H84O21[M+Na]+:1 079.542 8；Found:1 079.541 5。與文獻[19]對照，鑒定化合物7為hoyacarnoside I。

4 活性檢測

4.1 細胞的培養(yǎng)

B16細胞在濕度為95%、CO2濃度為5%的空氣中，37 ℃環(huán)境下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為10% FBS的DMEM。

4.2 黑色素含量的測定

B16細胞以每孔5×104個的密度接種在24孔板上培養(yǎng)24 h后，待細胞完全貼壁后，棄去上層培養(yǎng)基，加入不同濃度的含藥培養(yǎng)500 μL，設定正常組和陽性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，PBS清洗3次，胰酶消化，收集細胞到離心管中，10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用含有10% DMSO的2 mol/L NaOH 150 μL溶解黑色素，并于80 ℃水浴中保溫2 h，最后吸取溶解液100 μL轉(zhuǎn)移到96孔板中，通過每孔上清液在405 nm波長下的吸收度，測定黑色素的含量用相對于空白對照吸收度的百分比表示，含量的百分比越小，證明樣品對黑色素生成的抑制作用越強。

4.3 存活率活性的測定

B16細胞以每孔5×103個細胞接種在24孔板上培養(yǎng)24 h后，待細胞完全貼壁后棄去上層培養(yǎng)基，加入含有相應濃度的含藥培養(yǎng)基100 μL，設定正常組和陽性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入DMSO溶液100 μL，室溫振搖10 min，通過每孔在570 nm波長下的吸收度，并計算B16細胞的存活率。

4.4 活性測定結(jié)果

由圖2可知，不同的萃取部位對黑色素生成均顯示較強的抑制活性，同等濃度下，所有萃取部位抑制黑色素的活性均強于陽性對照熊果苷，同時對B16細胞的毒性較小，在10～100 μg/mL范圍內(nèi)，萃取物濃度越高反而對細胞的毒性越小。而且大部分化合物抑制黑色素生成活性表現(xiàn)出濃度依賴性，其中化合物5當濃度達到30 μmol/L時，抑制黑色素生成的活性明顯提高。

5 結(jié)果與討論

本研究對A.mannii葉的化學成分進行初步研究，分離并鑒定了7個化合物，均為首次從該植物中分離得到，本研究成果豐富了A.mannii的化學庫，為其藥用價值的開發(fā)利用提供了研究基礎。本文對分離得到的7個化合物在B16細胞株上進行了細胞存活率實驗，結(jié)果顯示大部分化合物對B16細胞存活率影響較小，在不影響細胞存活率的條件下，大部分化合物能夠抑制α-MSH誘導黑色素的生成，且與陽性對照藥熊果苷活性相當。同時，不同萃取部位的抑制黑色素生成活性高、毒性小這一點不容忽視，以萃取部位作為美容產(chǎn)品進一步開發(fā)也可作為后期研究方向。

目前本研究對A.mannii的成分分離還不夠徹底全面，不同種類的化合物無規(guī)律性，故在后期的研究中，仍需對各部位進行系統(tǒng)徹底的分離鑒定，更進一步豐富該植物的化合物庫。