李馳坤 歐喜燕 張永和 陳聲武 李曉兵

【摘要】目的 通過急性心肌損傷動物實驗，觀察苦心丸對心肌缺血模型大鼠Glut4、AKT蛋白表達的影響。方法 采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支法復制心肌缺血模型，以葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（Glut4）和大鼠磷酸化AKT蛋白（AKT）為指標，探討苦心丸改善心肌缺血的作用機制。結(jié)果 與模型組比較，苦心丸中劑量組和低劑量組動物血清Akt蛋白含量高于模型組，苦心丸高、中、低劑量組動物GLUt4蛋白水平均高于模型組。結(jié)論 苦心丸可以促進心肌缺血動物模型Akt和 GLUt4蛋白的表達，對于抑制損傷心肌細胞凋亡和對缺血心肌損傷有一定的保護作用。

【關(guān)鍵詞】苦心丸;心肌缺血;葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4;磷酸化AKT蛋白

【中圖分類號】R259 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.36..02

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選用由吉林大學基礎醫(yī)學院提供的清潔級Wistar大鼠，雌、雄大鼠比例為1：1，體重250～280 g。

1.2 實驗藥品與試劑

（1）苦心丸（長春中醫(yī)藥大學研發(fā)中心生產(chǎn)，0.3 g/粒，含生藥8.3 g，批號20100201）;（2）復方丹參滴（天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，27 mg/粒，國藥準字Z10950111，批號100309）;（3）試劑：烏來糖，分析純，500 g/瓶，批號T20100310，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號30191228;注射用青霉素鈉，規(guī)格：160萬單位/瓶，國藥準字H13020655，生產(chǎn)批號：E1005503，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（Glut4）試劑盒，規(guī)格：96T，上海科敏生物科技有限公司生產(chǎn)，批號20120602;大鼠磷酸化AKT蛋白（AKT）ELISA試劑盒，96T，上?？泼羯锟萍加邢薰旧a(chǎn)，批號20120602。

1.3 實驗主要儀器

酶標儀：BIO680，美國伯樂公司產(chǎn)品;臺式高速冷凍離心機：型號：Biofuge stratos，德國SORVALL產(chǎn)品;熱恒溫鼓風干燥箱，型號：DHG-9003BS-Ⅲ型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 實驗方法

2.1.1 實驗分組

按隨機方式將實驗大鼠分成6組，即假手術(shù)組、模型組、陽性對照組（復方丹參滴丸）、苦心丸高、中、低劑量各1組，每組中均包含5只雌大鼠、5只雄大鼠。

2.1.2 給藥途徑、方法及劑量

實驗大鼠均通過灌胃方式給藥，劑量如下：苦心丸高、中、低劑量組分別為1.48 g/kg、0.74 g/kg、0.37 g/kg體重;陽性對照藥組用藥為復方丹參滴丸，劑量為250 mg/kg體重。以上各組給藥均為1次/d，共連續(xù)7 d，第7 d給藥后30 min進行心肌缺血模型的復制。

2.1.3 大鼠心肌缺血模型復制方法

按照文獻中描述的結(jié)扎左冠狀動脈前降支法進行適當改進再進行心肌缺血模型的復制。

首先使用乙醚將實驗大鼠麻醉，選定胸正中為手術(shù)區(qū)域，去毛備皮消毒，做好關(guān)閉胸腔的荷包縫合準備，之后沿鎖骨正中線做2 cm縱向切口切開皮膚，在第四或第五肋間將大鼠胸部肌肉進行鈍性分離，使胸骨、肋骨充分暴露，將胸腔打開，心包剪開，在胸廓輕輕按壓以將大鼠心臟擠出。使用無創(chuàng)性縫合線在動脈圓錐與左心耳之間冠狀靜脈處進行冠狀動脈的結(jié)扎，之后將心臟迅速放回原位，將胸腔氣體擠出，并迅速將縫合線拉緊，將胸腔逐層進行關(guān)閉，將外皮縫合好，保證開胸時間<60 s。

對于假手術(shù)組大鼠，無創(chuàng)性縫合線穿過左冠狀動脈，但不結(jié)扎，其余操作方法同上。

造模成功：結(jié)扎部位下的心肌顏色發(fā)白，心肌搏動明顯減弱，心電圖ST段弓背抬高幅度明顯。

2.1.4 指標檢測

從造模成功的大數(shù)中選取雌鼠、雄鼠各24只，每組包括雌鼠、雄鼠各4只。造模成功24 h后向大鼠腹腔注射20%烏來糖注射液進行麻醉，劑量為1 ml/100 g。使用無菌注射器在大鼠腹主動脈末端采集5 mL血液標本，在4℃以下條件下進行離心，轉(zhuǎn)速為3000 r/min，時間為10 min，之后取上清液，在-80℃條件下進行保存。

2.1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以“x±s”表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 實驗結(jié)果

苦心丸對心肌缺血模型大鼠心肌糖代謝基因Akt、GLUt4蛋白水平表達的影響。檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，苦心丸中劑量組和低劑量組動物血清AKT蛋白含量高于模型組，苦心丸高、中、低劑量組動物GLUt4蛋白水平均高于模型組。結(jié)果表明苦心丸可以促進心肌缺血動物模型Akt和GLUt4蛋白的表達。對于抑制損傷心肌細胞凋亡和對缺血心肌損傷有一定的保護作用。

3 討 論

要想保持心臟功能正常運行，需要足夠的氧及氧化產(chǎn)物產(chǎn)生腺苷三磷酸（ATP），其中又以長鏈脂肪酸作為主要供能來源。在心肌缺血缺氧的情況下，直接影響到心肌代謝功能，葡萄糖代謝則在心肌供能中扮演重要角色，葡萄糖從細胞外進入細胞需要糖轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)助運輸，糖轉(zhuǎn)運蛋白是細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖的載體，Akt和Glut4在糖代謝活動信號轉(zhuǎn)導途徑中起重要調(diào)節(jié)作用。

GLUt4主要分布在細胞內(nèi)，通常不參與葡萄糖的轉(zhuǎn)運，但是心肌缺血缺氧情況下，受到胰島素刺激作用，可以使GLUt4到細胞膜上幫助葡萄糖轉(zhuǎn)運，而GLUt4的易位又與Akt/PKB信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)聯(lián)。Akt的生物作用很多，例如促進蛋白合成、減少細胞凋亡、增強心肌收縮功能等。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定的野型PKB過度表達大鼠能夠提高Glut4水平，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運功能，Akt活化能夠有效保護缺血心肌。心肌缺血缺氧，收縮功能降低時，磷酸化Akt和Glut4表達的增強幅度顯著，提示缺血后心肌的Akt和Glut4對于糖代謝有調(diào)節(jié)作用。因此缺血心肌糖代謝基因Akt、GLUt4 的蛋白水平表達研究對于闡明苦心丸中抗心肌缺血有效成分的作用機理有重要意義。

參考文獻

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本文編輯：劉欣悅