舒雄，杰永生，鄭蕊，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊

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離心重力誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細胞向軟骨樣細胞分化

舒雄，杰永生，鄭蕊，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊

100035 北京積水潭醫(yī)院/北京市創(chuàng)傷骨科研究所

探討離心重力對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞（hADSCs）向軟骨樣細胞分化以及對 Wnt/β-catenin 信號通路的影響。

通過加載不同離心力（0、500、1000、2000、2500、3000 ×）和持續(xù)時間（0、15、30、45、60 min）刺激脂肪干細胞分化為軟骨樣細胞，并利用熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測 Sox 9 基因的上調(diào)表達來篩選條件，將培養(yǎng)的 P3代 hADSCs 分 3 組，對照組（不干預(yù)處理）、離心重力組和 TGF-β3 組（加入 TGF-β3 成軟骨誘導(dǎo)劑），持續(xù)培養(yǎng) 21 d 后，通過阿利辛藍和蘇木精-伊紅染色進行軟骨分化鑒定，DMMB 法測定胞外基質(zhì)中 GAG 含量，熒光定量 PCR 測定 II 型膠原基因表達，Western blot 進一步檢測對照組和離心重力組中 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和 p-GSK3β 蛋白的表達。

加載最適的離心重力（2500 ×，30 min）刺激 hADSCs 后，培養(yǎng) 24 h，Sox 9 的 mRNA 和蛋白表達顯著上調(diào)。阿利辛藍和蘇木精-伊紅染色顯示，離心重力組和 TGF-β3 組中軟骨表達呈陽性。GAG 實驗結(jié)果顯示，TGF-β3 組促 GAG 分泌的能力優(yōu)于離心重力組（< 0.05），熒光定量 PCR 結(jié)果表明 TGF-β3 組其 II 型膠原 mRNA 表達的能力高于離心重力組（< 0.05），Western blot 結(jié)果顯示，相比對照組，離心重力組中 β-catenin 和 p-GSK3β 的蛋白表達水平降低，而 GSK3β 和 Sox 9 蛋白表達升高。

離心重力和 TGF-β3 誘導(dǎo)脂肪干細胞成軟骨分化中的表達具有相似的能力，離心重力對 hADSCs 誘導(dǎo)成軟骨作用與抑制 Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)。

人脂肪干細胞； 超重力； Sox 9 轉(zhuǎn)錄因子類； 軟骨分化

關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上的常見病。由于軟骨無血管和神經(jīng)供應(yīng)，僅靠關(guān)節(jié)液的營養(yǎng)供應(yīng)，一旦受損很難自行修復(fù)。目前對軟骨缺損的修復(fù)治療方法包括關(guān)節(jié)鏡下清理術(shù)、微骨折術(shù)、軟骨移植、軟骨細胞移植、組織工程技術(shù)修復(fù)等[1-2]。新興的組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為軟骨再生提供了新的思路。脂肪干細胞容易獲取，損傷小，不易凋亡，無年齡限制，分化能力強，目前被認為在軟骨組織工程中是比骨髓間充質(zhì)干細胞更為理想的種子細胞[3-4]。軟骨組織工程中種子細胞誘導(dǎo)分化為軟骨細胞一直是研究的熱點。眾所周知，機械應(yīng)力能誘導(dǎo)干細胞成軟骨分化[5]，離心重力是一種主要由離心產(chǎn)生，易于使用和可控的機械應(yīng)力。通過離心誘導(dǎo)細胞基因表達，在肺上皮癌細胞中，離心法可上調(diào)白細胞介素-1β 的表達[6]。因此，作為一種機械應(yīng)力，離心重力可以誘導(dǎo)干細胞軟骨細胞的基因表達。另外，轉(zhuǎn)化生長因子 β（TGF-β）家族因具有良好的促干細胞成軟骨分化能力，常作為軟骨組織工程中的誘導(dǎo)因子，且 TGF-β3 相較于傳統(tǒng)的 TGF-β1，促進人間充質(zhì)干細胞成軟骨分化能力更強[7]。本實驗以人脂肪干細胞作為種子細胞，在培養(yǎng)體系中加入 TGF-β3 細胞因子，比較離心重力和 TGF-β3 培養(yǎng)方式成軟骨效果的差異，探索離心重力誘導(dǎo)效果是否是更好的培養(yǎng)體系，為下一步臨床利用脂肪干細胞修復(fù)軟骨損傷奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 人脂肪組織來源于北京知音創(chuàng)美醫(yī)療美容門診部吸脂者，女性，抽吸部位為腹部，術(shù)后無菌保存。I 型膠原酶、胰酶、Trizol 試劑、高糖 DMEM、低糖 DMEM 和胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco 公司；阿利辛藍染料、蘇木精-伊紅染料購自北京索萊寶生物科技有限公司；地塞米松、ITS+ 購自美國 Sigma 公司；TGF-β3 購自Pepro tech 公司；cDNA Synthesis SuperMix 和UltraSYBR Mixture 購自日本 Takara 公司；Sox 9、β-catenin 和 p-GSK3β 抗體購自美國 CST 公司；HRP-羊抗鼠 IgG 和 HRP-驢抗兔二抗購自 Jackson 公司。

1.1.2 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國 Shellab 公司；往復(fù)式真空泵購自上海益化真空設(shè)備有限公司；倒置相差顯微鏡購自日本 Olympus 公司；冷凍大容量離心機購自湘儀離心機儀器有限公司；熒光定量 PCR 儀購自美國 Bio-Rad 公司；Nanodrop ND-2000 分光光度計購自美國 Thermo Fisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs 的分離及培養(yǎng) 無菌條件下取脂肪組織，將脂肪組織在 PBS 中清洗 3次，徹底去除紅細胞與組織碎片。按照本室之前報道分離脂肪干細胞步驟進行[8]，調(diào)整細胞密度接種于含 10% FBS（10 ng/ml）和 1% 的青鏈霉素的低糖 DMEM 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞達到 80% ~ 90% 融合，取 P3代對數(shù)生長期細胞備用。

1.2.2 離心重力加載 將P3代 hADSCs 轉(zhuǎn)移到一個新的 15 ml 離心管，設(shè)置不同的離心引力（0、500、1000、1500、2000、2500 和 3000 ×）和離心持續(xù)時間（0、15、30、45 和 60 min）。離心重力加載后，細胞混合不完全軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種至培養(yǎng)皿中，按照所需時間點培養(yǎng)。

1.2.3 誘導(dǎo)hADSCs 成軟骨細胞分化 將 P3代 hADSCs 以 5 × 105cells，300 ×離心 5 min，棄掉上清，加入 2 ml 不完全軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。其成分為：高糖 DMEM 加入 100 U/ml 青、鏈霉素、10% FBS、10 nmol/L 地塞米松、ITS+（含 6.25 μg/ml胰島素、6.25 μg/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25 μg/ml 亞硒酸、5.33 μg/ml 亞油酸、1.25 mg/ml BSA）。24 h 后細胞聚集成球，TGF-β3 組換用添加 10 ng/ml TGF-β3 的完全培養(yǎng)基，對照組繼續(xù)不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔 2 天全量換液，按照所需時間點培養(yǎng)后，收獲細胞。

1.2.4 實時定量 PCR 檢測基因表達 利用Trizol法提取各組誘導(dǎo)細胞中總 RNA，根據(jù)試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，57 ℃、1 min，40 個循環(huán)，57 ℃延伸 1 min。檢測相關(guān)目的基因，以 GAPDH為內(nèi)參基因，各引物序列見表 1，采用 ΔΔCt 法計算各組基因相對表達量。

1.2.5 組織學(xué)染色 取各組的誘導(dǎo)細胞，PBS 洗 1 次，4% 多聚甲醛 4 ℃固定過夜，脫水后石蠟包埋，切片后染色，分別進行阿利辛藍染色和蘇木精-伊紅染色，鏡下觀察。

1.2.6 糖胺多糖含量測定 各組留存的組織消化液 50 μl 加入 96 孔板，加入 200 μl 預(yù)先配置好的 DMMB 染色液。利用二甲基亞甲基藍（DMMB）比色法測定糖胺多糖的含量，實驗步驟依據(jù) GENEMD 糖胺多糖總含量二甲基亞甲基藍比色法定量檢測試劑盒說明書進行。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達 各組的細胞通過 RIPA 裂解后，BCA 定量，經(jīng)SDS-PAGE 分離后，采用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到 PVDF 上。將膜放在 5% 的脫脂奶（溶于 PBS，pH 7.4）中，4 ℃封閉過夜，與 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和 p-GSK3β 的一抗 37 ℃下孵育 1 h，PBS 清洗后與 HRP 標記的驢抗兔 IgG 和 HRP-羊抗鼠 IgG（1:1000），常溫下孵育 1 h。TBST 洗膜 5 次后用 ECL 發(fā)光試劑盒顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 離心重力增加 hADSCs 中 Sox 9 基因的表達

Sox 9 基因是軟骨細胞分化的主要調(diào)節(jié)，篩選的離心重力刺激 ADSCs 誘導(dǎo) Sox 9 基因表達上調(diào)。通過加載不同離心重力（0、1000、1500、2000、2500、3000 ×）15 min 刺激已成功分離純化和鑒定的 hADSCs，離心力刺激后的細胞，重新接種在細胞培養(yǎng)皿中，靜置培養(yǎng) 24 h，熒光定量 PCR 結(jié)果顯示在 2500 ×的離心重力作用 15 min 后hADSC 中 Sox 9 的 mRNA 表達顯著性增加，相比沒有加載離心重力的 hADSCs 的對照組，在2500 ×離心重力下的 Sox 9 的 mRNA 表達量增加 3.6 倍（圖 1A）。此外，為了優(yōu)化離心重力的加載時間，加載 2500 ×的離心力條件下比較不同時間點（0、15、30、45、60 min）hADSCs 中的 Sox 9 的 mRNA 表達，研究發(fā)現(xiàn)加載 2500 ×離心重力在 5、15、60 min，hADSCs 中 Sox 9 的 mRNA 表達無明顯增加，而在 30 min 時其有顯著上調(diào)（圖 1B）。熒光定量 PCR 和 Western blot 實驗結(jié)果顯示離心重力在 2500 ×，離心時間維持 30 min 時，刺激 hADSCs 誘導(dǎo) Sox 9 基因和蛋白上調(diào)表達最佳（圖 1C 和 1D）。

表 1 PCR 引物序列

圖 1 離心重力增加人脂肪干細胞中 Sox 9 的表達[A：離心重力的優(yōu)化；B：離心時間的優(yōu)化；C：對照組和離心重力組（2500 × g，30 min）中 Sox 9 的 mRNA 表達；D：對照組和離心重力組（2500 × g，30 min）中 Sox 9 的蛋白表達]

Figure 1 Centrifugal gravity increased Sox 9 expression in hADSCs (A: Optimization of CG; B: Optimization of centrifugal time; C: Expression of Sox 9 mRNA in hADSCs stimulated with or without 2500 ×for 30 min; D: Expression of Sox 9 protein in hADSCs stimulated with or without 2500 ×for 30 min)

2.2 離心重力和 TGF-β3 刺激后 hADSCs 的組織學(xué)評價

離心重力組和 TGF-β3 組誘導(dǎo) hADSCs 成軟骨誘導(dǎo) 21 d 后，細胞軟骨特異性染色阿利辛藍呈陽性，證實兩組細胞外基質(zhì)有蛋白聚糖表達。同時發(fā)現(xiàn)離心重力刺激 hADSCs 與 TGF-β3 誘導(dǎo)軟骨細胞分化的表達程度水平相似，但 TGF-β3 組的陽性表達更強（圖 2）。

2.3 DMMB 檢測離心重力和 TGF-β3 刺激 hADSCs 的 GAG 含量

按照 DMMB 比色法說明書測定 GAG 的含量，對照組、離心重力組和 TGF-β3 組刺激 hADSCs 后，檢測 3 組中第 7 天、第 14 天和第 21 天 GAG 含量的表達。研究比較顯示，第 7 天時，TGF-β3 組 GAG 含量略微高于離心重力組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05），第 14 天時，TGF-β3 組 GAG 含量高于重力組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05），第 21 天時，離心重力組 GAG 含量顯著高于 TGF-β3 組（< 0.05）（圖 3A）。

2.4 熒光定量 PCR 檢測離心重力和 TGF-β3 刺激 hADSCs 的 II 型膠原基因表達

離心重力組、TGF-β3 組和對照組經(jīng)不同的培養(yǎng)條件刺激后連續(xù)培養(yǎng) 21 d，熒光定量 PCR 檢測三組hADSCs 細胞團塊中 II 型膠原 mRNA 表達，發(fā)現(xiàn) TGF-β3 組的 II 型膠原 mRNA 相對表達量顯著高于離心重力組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05)（圖 3B)。

圖 2 離心重力和 TGF-β3 刺激 hADSCs 后組織學(xué)評價（× 40）（A：離心重力組阿利辛藍染色；B：TGF-β3 組阿利辛藍染色；C：離心重力組 HE 染色；D：TGF-β3 組 HE 染色）

Figure 2 Histological evaluation of hADSCs after CG and TGF-β3 stimulation (× 40) (A: Alcian blue staining of the CG group; B: Alcian blue staining of the TGF-β3 group; C: HE staining of the CG group; D: HE staining of the TGF-β3 group)

圖 3 離心重力和 TGF-β3 刺激 hADSCs 軟骨特征的表現(xiàn)（A：DMMB 比色法測定各組 GAG 含量；B：熒光定量PCR 測定各組 II 型膠原 mRNA 的含量）

Figure 3 CG and TGF-β3 stimulated hADSCs showed chondrogenic characteristics (A: Level of GAG in various groups by DMMB quantitative assay; B: Level of type II collagen mRNA in various groups by real-time PCR)

2.5 Western blot 檢測離心重力后 hADSCs 中 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和p-GSK3β 蛋白表達

為了進一步探討離心重力刺激 hADSCs 對其 Wnt/β-catenin 信號通路的影響，對培養(yǎng) P3代的 hADSCs 細胞，分對照組和離心重力組，重力離心刺激后，培養(yǎng) 24 h 后，Western blot 檢測兩組細胞中 Sox 9、GSK3β、p-GSK3β 蛋白以及活化 β-catenin 的蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，相比對照組，離心重力組的 GSK-3β 蛋白的磷酸化水平減低，同時活化 β-catenin 蛋白水平減少，而 GSK3β 和 Sox 9 蛋白水平增加（圖 4）。說明離心重力可通過對 Wnt/β-catenin 信號通路的抑制，激活 Sox 9蛋白表達上調(diào)。

圖 4 離心重力刺激人脂肪干細胞對Wnt/β-catenin 信號通路的影響

Figure 4 The effect of CG on Wnt/β-catenin signaling pathway in hADSCs

3 討論

創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)軟化癥引起的軟骨損傷在臨床上很常見。傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)方法如微骨折、自體軟骨細胞移植等，這些方法都有各自局限性。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，組織工程技術(shù)為軟骨損傷提供了新的途徑。多項研究已表明，與其他來源骨髓間充質(zhì)干細胞相比，脂肪干細胞可從全身多處部位提取，來源豐富，還具有增殖快、數(shù)量眾多、免疫原性低、不易造成損傷等優(yōu)點[9-11]。據(jù)文獻報道，機械應(yīng)力通過上調(diào)相關(guān)軟骨基因誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨化，剪切力有助于人骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞外基質(zhì)成軟骨化[12]?？紤]到離心機是一種常見的實驗室設(shè)備，離心是細胞收獲和分離中一種常用的手段。因此，我們推測離心重力作為機械應(yīng)力的一種常見形式，可能有助于脂肪干細胞成軟骨分化。

在本實驗中，我們首先分離培養(yǎng) hADSCs 至 P3代后，以 Sox 9 基因表達作為衡量標準，通過熒光定量 PCR 和 Western blot 篩選最佳離心力 2500 ×和最佳離心時間 30 min，離心重力刺激 24 h 后，Sox 9 mRNA 的表達量是對照組三倍以上。離心重力刺激 hADSCs 成軟骨分化過程中 Sox 9 基因表達顯著增加。另據(jù)文獻報道 TGF-β3 是細胞因子中 TGF 家族的主要成員之一，可促進脂肪干細胞的增殖分化、促進細胞外基質(zhì)形成，在創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，尤其在軟骨的生長和重建中起關(guān)鍵作用。我們進一步通過離心重力和 TGF-β3 兩種培養(yǎng)體系將 P3代脂肪干細胞誘導(dǎo)成軟骨后 21 d，通過阿利辛藍和 HE 染色，離心重力組和 TGF-β3 組的染色顯陽性，前者比后者陽性表達偏低。進一步采用 DMMB 法測定 GAG 含量和熒光定量 PCR 測定 II 型膠原，發(fā)現(xiàn)離心重力組 GAG 含量和 II 型膠原相對偏低。我們分析發(fā)現(xiàn)，可能是離心重力一次刺激 hADSCs，而對于 TGF-β3 因子能多次持續(xù)刺激 hADSCs，因而 TGF-β3 組相應(yīng)的蛋白聚糖和 II 型膠原表達顯著偏高。對于潛在的臨床應(yīng)用，應(yīng)采用多次離心重力持續(xù)刺激 hADSCs，來維持其分化成軟骨樣細胞的表達狀態(tài)。研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路與關(guān)節(jié)軟骨去分行和抑制軟骨凋亡有密切關(guān)系，Wnt/β-catenin 信號通路的激活可以組織 ADSCs 向軟骨細胞分行，Luo 等[13]{Luo, 2013 #179}在 ADSCs 向軟骨細胞分行過程中，加入 Wnt1 后激活 Wnt/β-catenin 信號通路，從而降低糖胺聚糖、Sox 9 和II型膠原的基因和蛋白表達，我們研究發(fā)現(xiàn)，相比對照組來說，離心重力組 GSK-3 的磷酸化水平和活化 β-catenin 的蛋白水平降低，導(dǎo)致 Wnt/β-catenin 信號通路下游基因的表達減少，而其 Sox 9 蛋白表達增強。該研究結(jié)果證明離心重力可以抑制 Wnt/β-catenin 信號通路，增強 Sox 9 基因的表達，維持脂肪干細胞分化而保持軟骨化的表型。

我們證實離心重力通過增加 Sox 9 和減少 β-catenin 蛋白表達誘導(dǎo) ADSCs 成軟骨樣分化。研究結(jié)果提示離心重力刺激 hADSCs 可以有效地改善干細胞成軟骨再生的便利，同時也降低了經(jīng)濟成本。雖然在這項研究中探討了 hADSCs 分離制備后誘導(dǎo)成軟骨的臨床前相關(guān)體外試驗，但是，如何通過體外多次離心持續(xù)誘導(dǎo) hADSCs 的分化需要進一步驗證，同時，離心重力 hADSCs 在動物體外的修復(fù)效果及其在修復(fù)中如何調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路也有待闡明。

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Differentiation of adipose-derived stem cells into cartilage-like cells induced by centrifugal gravity

SHU Xiong, JIE Yong-sheng, ZHENG Rui, CHEN Lei, JIN Shao-feng, QI Hui, SUN Lei

Author Affiliation: Beijing Jishuitan Hospital, Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, 100035 Beijing, China

To investigate the effect of centrifugal gravity (CG) on chondrogenic differentiation and Wnt/β-catenin signaling pathway in human adipose-derived stem cells (hADSCs).

hADSCs were stimulated by loading different degrees of CG (0, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 and 3000 ×) and different time points (0, 15, 30, 45, 60 min) to induce chondrogenic differentiation. After the hADSCs were cultured to the 3rd generation and the cells were divided into 3 groups, the control group without intervention, the CG group and the TGF-β3 group added TGF-β3 into cartilage induction agent. At the 21st day, the three groups were observed by Alcian blue and HE staining. The expression level of glycosaminoglycan (GAG) in extracellular matrix was determined by dimethylmethylene blue (DMMB) method. The expression of type II collagen gene was assessed by real-time polymerase chain reaction (PCR). Sox 9, β-catenin, GSK3β and p-GSK3β proteins from the control group and the CG group were detected by Western blot.

The mRNA and protein expression of Sox 9 from hADSCs was up-regulated by CG (2500 ×for 30 min) after 24 h of culture. Alcian blue and HE staining showed positive expression of cartilage in the CG group and TGF-β3 group, the results of GAG showed that the ability to secrete GAG in the TGF-β3 group was better than that of the CG group (< 0.05), and the expression of type II collagen (mRNA) in the control group was higher than that in the CG group (< 0.05). Compared with the control group, the results from Western blot showed that the expression level of β-catenin and p-GSK3β with CG group decreased, while the expression of GSK3β and Sox 9 increased.

CG induces Sox 9 expression as TGF-β3 with a similar ability and could induce chondrogenic differentiation of hADSCs via inhibiting Wnt/β-catenin signaling pathway.

Humanadipose-derived stem cells; Hypergravity; Sox 9 transcription factor; Chondrogenic differentiation

: SUN Lei, Email: dr_sunlei@263.net; QI Hui, Email: Kellyqhqh2002@163.com

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項（首發(fā)2011-1006-01）；北京市科技新星計劃（H013610310113）

孫磊，Email：dr_sunlei@263.net；綦惠，Email：Kellyqhqh 2002@163.com

2017-11-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.