李佳

?

FABP-5基因沉默對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞生物學(xué)特性及人參川穹嗪敏感性的影響

李佳

110016 沈陽(yáng)，遼寧電力中心醫(yī)院消化內(nèi)科，lijiaxhnk@ 163.com

探討通過 siRNA 干擾技術(shù)沉默表皮脂肪酸結(jié)合蛋白-5（FABP-5）基因表達(dá)對(duì)人肝癌 Bel-7402 細(xì)胞生物學(xué)特性及人參川穹嗪敏感性的影響。

以人肝癌 Bel-7402 細(xì)胞為研究對(duì)象，根據(jù) FABP-5 mRNA 編碼序列設(shè)計(jì)并合成干擾 siRNA 序列，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 Bel-7402 細(xì)胞。將人肝癌 Bel-7402 細(xì)胞分為 FABP-5 siRNA 組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。用 RT-PCR 和 Western blot 法分別從 mRNA 水平和蛋白水平檢測(cè) FABP-5 基因的表達(dá)；CCK8 法測(cè)定細(xì)胞體外增殖能力；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期和凋亡的變化情況；細(xì)胞侵襲小室法檢測(cè)各組細(xì)胞的體外侵襲力；MTT 法觀察 FABP-5 基因沉默后 Bel-7402 細(xì)胞對(duì)人參川穹嗪的敏感性。

RT-PCR 和 Western blot 顯示，F(xiàn)ABP-5 siRNA 組較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的FABP-5 mRNA 和蛋白表達(dá)都明顯下降；FABP-5 siRNA 組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢，細(xì)胞周期阻滯在 G0/G1期，S 期細(xì)胞數(shù)減少；與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，F(xiàn)ABP-5 siRNA 組細(xì)胞的凋亡率明顯升高（< 0.01），增殖、侵襲能力顯著下降（< 0.05）；FABP-5 siRNA組細(xì)胞對(duì)人參川穹嗪的敏感性顯著增強(qiáng)（< 0.05）。

特異性沉默 FABP-5 基因表達(dá)能夠降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力，抑制細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞周期阻滯于 G0/G1期，使其凋亡顯著增加。

脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)類； RNA 干擾； 肝腫瘤； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡； Bel-7402 細(xì)胞； 人參川穹嗪

肝癌是最為常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病原因與環(huán)境因素、生活方式等密切相關(guān)。其發(fā)生率較高，初期癥狀不明顯，出現(xiàn)癥狀后通常已經(jīng)到了末期，失去治療時(shí)間[1-3]。肝癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移是此病最典型的特征，但目前為止癌細(xì)胞擴(kuò)散及遷移的分子機(jī)制尚不清楚。目前肝癌的治療仍有重要障礙，臨床上使用的放化療、介入、射頻消融等治療手段對(duì)患者生存期的提高效果并不理想[4-5]。研究表明，在肝癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程中及不同的發(fā)展時(shí)期均有許多基因的參與及調(diào)控，把外源基因利用特定的方法轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，可促進(jìn)靶向的調(diào)控功能[6-7]。皮層型脂肪酸結(jié)合蛋白-5（fatty acid binding protein-5，F(xiàn)ABP-5）是上皮細(xì)胞中的脂肪酸連接蛋白，分子量 14 ~ 16 kD，在多種癌癥中 FABP-5 水平上調(diào)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中存在大量的 FABP-5，F(xiàn)ABP-5 可進(jìn)入肝臟細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮可能的調(diào)控功能，其在肝癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。本課題通過 siRNA 干擾方法敲低 FABP-5 表達(dá)水平，觀察其對(duì)人肝癌 Bel-7402 細(xì)胞生物學(xué)特征及人參川穹嗪敏感性的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人肝癌 Bel-7402 細(xì)胞購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；胰蛋白酶及 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；Opti-MEM 和 G418 購(gòu)自美國(guó) Gibco BRL 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自上海四季青公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000TM和 Trizol 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；RT-PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海寶曼生物科技公司；AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司；cDNA 合成試劑盒和 RNA 干擾引物購(gòu)自北京賽百盛生物科技公司；PCR 引物序列由上海吉爾生化有限公司合成；CCK8 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人 FABP-5 抗體購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 購(gòu)自美國(guó) Abcam Santa 公司；鼠抗 GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó) Cruz 公司；HRP 標(biāo)定的兔抗羊 IgG 購(gòu)自福州邁新生物科技公司；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；RIPA 蛋白裂解液及 BCA 蛋白標(biāo)定檢測(cè)盒購(gòu)自江蘇碧云天公司；Matrigel gel購(gòu)自美國(guó) BD 公司；人參川芎嗪注射液購(gòu)于安徽天洋藥業(yè)公司（人參與川芎嗪按 9:1 配置）。

1.2 方法

1.2.1 FABP-5 siRNA 的設(shè)計(jì)、合成及轉(zhuǎn)染 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)靶向人類 FABP-5 siRNA 序列，正義鏈為：5' ATCCGCTACAGCGAGTACGTTTAC CTGTGAAGCCACAGATGGGGTAAACGTACTCG CTTAGCTTTTTTG 3'；反義鏈為：5' AATFCAAA AAAGCTACAGCGAGTACGTTTACCCCATCTGT GGCTTCACAGGTAAACGTACTCGCTGTAGCG 3'。陰性對(duì)照 siRNA 正義鏈為：5' GATCCGCGAGA CCTCAGTATGTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAACATACTGAGGTCTCGCTTTTTTG 3'；反義鏈為：5' AATTCAAAAAAGCGAGACCTCAG TATGTTACCCATCTGTGGCTTCACAGGTAACATACTGAGGTCTCGCG 3'。人肝癌胞株 Bel-7402 放于含 10%胎血清的 DMEM 基中，置于 37 ℃、5%CO2密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)并傳代。選取對(duì)數(shù)期長(zhǎng)勢(shì)的細(xì)胞按 2 × 105個(gè)/孔把肝癌細(xì)胞株 Bel-7402 種于 6 孔板內(nèi)，當(dāng)匯合度達(dá)到 80%時(shí)以脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)分為 3 組：轉(zhuǎn)染 pGenesil-1-FABP-5- siRNA 載體者為實(shí)驗(yàn)組（Bel-7402/FABP-5-siRNA 組），轉(zhuǎn)染 NC siRNA 載體者為對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染的肝癌Bel-7402 為空白組。于轉(zhuǎn)染后 48 h 進(jìn)行 RNA 干擾效應(yīng)的檢測(cè)。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè) FABP-5 基因的表達(dá) 人肝癌細(xì)胞株 Bel-7402 經(jīng) 4 ℃離心 20 min，棄去培養(yǎng)液，用 PBS 清洗 3 次，通過 Trizol 法提總 RNA。根據(jù) PCR 檢測(cè)試劑盒說明書步驟將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。分別擴(kuò)增 FABP-5 和內(nèi)參 GAPDH。FABP-5 上下游引物序列設(shè)計(jì)：上游：5' TT GGTTGTGGGAAGTCGT 3'，下游：5' GCTTATGT AGTTAATGGGAGGT 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為 415 bp。GAPDH 上游：5' GAGTCAACGGATTGGTCGT 3'，下游：5' GACAAGCTTCCCGTTCTCAG 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為 185 bp。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃變性 3 min，94 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，循環(huán) 40 周期；72 ℃延伸 7 min。產(chǎn)物于 4 ℃保存。PCR 生成物采用 2% 的瓊脂糖電泳鑒定，使用凝膠成像體系進(jìn)行吸光度掃描并以 FABP-5 和 GAPDH 吸光值的比值考察 mRNA 水平。

1.2.3 Western blot 檢測(cè) FABP-5 蛋白的表達(dá) 人肝癌細(xì)胞株 Bel-7402 棄去培養(yǎng)基，加入 1 μl 的 PMSF 裂解液，混勻置于冰上作用 0.5 h，PBS 清洗 3 次，提取總蛋白，采用 BCA 法測(cè)得其密度。吸取 50 μg，DEPC 水補(bǔ)至 20 μl，加入等量 2 × 上樣緩釋液，99 ℃作用 10 min。5%濃縮膠 40 V 衡壓 1 h，10%分離膠恒壓 60 V、3.5 h，濕轉(zhuǎn) 14 V 恒壓 14 h，37 ℃搖床封存 2 h，加 1:1000 緩釋的 FABP-5 一抗，4 ℃過夜，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，加入 1:5000 的 HRP 標(biāo)記的二抗及 GAPDH，37 ℃搖床溫育 60 min。TBST 洗膜5 min，共洗 4 次。加入發(fā)光液，采用 ECL 法檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)連續(xù)重復(fù) 3 次。曝片后 Image-Pro Plus 7.0 系統(tǒng)分析跑帶的灰度值，用 FABP-5/GAPDH 表示 FABP-5 的水平。

1.2.4 CCK8 法測(cè)定 Bel-7402 細(xì)胞體外增殖能力 采集實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組的 Bel-7402，按 4000 個(gè)/孔的密度種于 96 孔板上，滴加含 10% 胎牛血清的 DMEM 培基 200 μl，每組設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白孔作為對(duì)照。置于 5% CO2飽和濕度、37 ℃的溫箱中，分別在 48、72、96、120 h 時(shí)加入 CCK8 20 μl，溫箱溫育 4 h 后，酶標(biāo)儀測(cè)量 490 nm 處的光密度（）值，每次選 5 個(gè)孔取均值制作生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) Bel-7402 細(xì)胞周期 收集實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組的Bel-7402，稀釋其密度為 1 × 106/L，冷 PBS 清洗 2 次，用 4 ℃ 70 % 的酒精混勻待用，再用 PBS 調(diào)細(xì)胞濃度為 1 × 106/L 與含 50 μg/ml RNA 酶的 Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4）共同孵育 30 min。100 μg/ml 碘化丙啶進(jìn)行細(xì)胞的 DNA 染色，暗室中放置 1 h 后，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞 DNA 數(shù)量排布，并計(jì)算各個(gè)周期細(xì)胞所占的比例。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè) Bel-7402 細(xì)胞凋亡情況 收集處理 72 h 后各組樣品，用不含EDTA 的胰酶處理，轉(zhuǎn)移到滅菌 1.5 ml EP 管中，4 ℃、2000 r/min 離心 5 min，棄上清；用 PBS 洗滌2 次，加入 500 μl 的 binding buffer 懸浮細(xì)胞，5 μl Annexin V-FITC 混勻后，加入 5 μl PI 混勻；室溫、避光反應(yīng) 5 ~ 15 min；1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng) Ex = 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng) Em = 530 nm。

1.2.7 Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Bel-7402細(xì)胞的侵襲能力 下室加入含 10% 的胎牛血清的 DMEN 培養(yǎng)基，于 transwell 上室鋪基質(zhì)膠50 μg/孔，取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組的 Bel-7402 細(xì)胞懸液 100 μl（細(xì)胞總數(shù)為 3 × 105/L）加入上室，置溫箱 24 h 后取出，刮除上室中未遷移、穿膜的細(xì)胞，4% 甲醛固定液作用 10 min，用 PBS 緩緩清洗 3 遍，經(jīng)蘇木精染色 10 min，PBS 清洗，晾干，濾過膜用中性樹膠粘于玻片上，封片；晾干后光鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)。每張膜各取 5 個(gè)視角，計(jì)算均數(shù)。每組平行設(shè) 3 個(gè)小室，重復(fù) 3 次。侵襲率（%）= 穿膜細(xì)胞數(shù)目/上室中種下的細(xì)胞總數(shù) × 100%。

1.2.8 MTT 檢測(cè)沉默 FABP-5 基因后 Bel-7402 對(duì)人參川穹嗪的敏感性 在 Bel-7402 細(xì)胞轉(zhuǎn)入干擾質(zhì)粒 48 h 后，收集細(xì)胞，種于 96 孔板，每個(gè)樣本做 3 個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的人參川穹嗪（5、10、20、50 mg/kg）培養(yǎng) 48 h；加入 MTT 20 μl（濃度為 5 mg/ml），置培育箱內(nèi)處理 4 h 后，棄去上清加 10% 的 SDS 200 μl。第 2 天，搖床上振搖 15 min，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)570 nm 處的吸光值（）。抑制率（%）=（對(duì)照–實(shí)驗(yàn)）/（對(duì)照–空白）× 100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 siRNA 抑制 FABP-5 mRNA 的表達(dá)

RT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果（圖 1）顯示，與對(duì)照組和空白組比較，實(shí)驗(yàn)組條帶明顯變窄，F(xiàn)ABP-5 mRNA 水平顯著降低。實(shí)驗(yàn)組與空白組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。

2.2 siRNA 抑制 FABP-5 蛋白的表達(dá)

Western blot 法檢測(cè)結(jié)果（圖 2）顯示，與對(duì)照組和空白組比較，實(shí)驗(yàn)組條帶明顯變窄，F(xiàn)ABP-5 蛋白水平顯著降低。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與空白組間灰度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（< 0.05）。

2.3 CCK8 法測(cè)定 Bel-7402 細(xì)胞體外增殖能力

CCK8 法檢測(cè)結(jié)果（圖 3）顯示，與對(duì)照組和空白組比較，F(xiàn)ABP-5 siRNA 組曲線轉(zhuǎn)染后 48、72、96 和 120 h 時(shí)均較低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均< 0.05），顯示 FABP-5 siRNA 組細(xì)胞增殖受到顯著抑制。

圖 1 RT-PCR 檢測(cè) Bel-7402 細(xì)胞中 FABP-5 mRNA 的表達(dá)（1：對(duì)照組；2：空白組；3：實(shí)驗(yàn)組）

Figure 1 The expression of FABP-5 mRNA in Bel-7402 cells was detected by RT-PCR (1: Control group; 2: Blank group; 3: Experimental group)

圖 2 Western blot 檢測(cè) Bel-7402 細(xì)胞中 FABP-5 蛋白的表達(dá)（1：對(duì)照組；2：空白組；3：實(shí)驗(yàn)組）

Figure 2 The expression of FABP-5 protein in Bel-7402 cells was detected by Western blot (1: Control group; 2: Blank group; 3: Experimental group)

圖 3 FABP-5 siRNA 對(duì) Bel-7402 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

Figure 3 Effect of FABP-5 siRNA on the growth of Bel-7402 cells

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) Bel-7402 細(xì)胞周期及凋亡

流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)組 G0/G1期細(xì)胞較對(duì)照組和空白組略有增加，S 期略有減少。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（< 0.05），M 期細(xì)胞無(wú)明顯變化（> 0.05）。說明細(xì)胞周期有明顯的 S 期阻滯（圖 4）。與對(duì)照組和空白組比照，實(shí)驗(yàn)組 Bel-7402 的凋亡率顯著上調(diào)（< 0.01）（圖 5）。

圖 4 流式細(xì)胞儀分析 Bel-7402 的細(xì)胞周期

Figure 4 Cell cycle analysis of Bel-7402 by flow cytometry

2.5 FABP-5 siRNA 組細(xì)胞體外侵襲力檢測(cè)結(jié)果

通過 transwell 法對(duì) Bel-7402 細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定結(jié)果（圖 6）表明，對(duì)照組和空白組穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)較多，分別為（58.13 ± 5.23）和（60.08 ± 6.27）；實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（27.57 ± 4.36），與對(duì)照組和空白組比較明顯減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（< 0.05）。結(jié)果表明特異性干擾 FABP-5 基因水平能明顯降低肝癌 Bel-7402 細(xì)胞的遷移能力。

圖 5 FABP-5 siRNA 組細(xì)胞的凋亡率明顯升高（A：對(duì)照組；B：空白組；C：實(shí)驗(yàn)組）

Figure 5 Apoptosis rate of FABP-5 siRNA cells was significantly increased (A: Control group; B: Blank group; C: Experimental group)

圖 6 蘇木精染色考察各組 Bel-7402 細(xì)胞侵襲力（A：對(duì)照組；B：空白組；C：實(shí)驗(yàn)組）（× 200）

Figure 6 Comparison of invasive ability of Bel-7402 cells in each group (A: Control group; B: Blank group; C: Experimental group) (× 200)

表 1 MTT 法檢測(cè)干擾 FABP-5 后人參川穹嗪對(duì) Bel-7402 細(xì)胞增殖的抑制率（%，）

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*< 0.05。

Note: Compared with experimental group,*< 0.05.

2.6 MTT 法檢測(cè)干擾 FABP-5 后 Bel-7402 對(duì)人參川穹嗪的敏感性

MTT 法檢測(cè)結(jié)果（表 1）顯示，干擾 FABP-5 后，Bel-7402 細(xì)胞對(duì)不同濃度的人參川穹嗪敏感性均提高。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)不同濃度的人參川穹嗪敏感性明顯高于對(duì)照組（< 0.05）。隨著藥物濃度的增加，人參川穹嗪對(duì) Bel-7402 的下調(diào)率也上調(diào)，呈現(xiàn)量效關(guān)系。

3 討論

腫瘤形成轉(zhuǎn)移的機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜且又彼此相關(guān)的，大致是通過以下兩種機(jī)制共同影響：其一，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖信號(hào)受到過度刺激，使細(xì)胞大量增殖、生長(zhǎng)失控；其二，細(xì)胞凋亡機(jī)制被抑制，細(xì)胞死亡消除受限[10-11]。在癌癥的生成進(jìn)展中，一些調(diào)控生長(zhǎng)及分化的相關(guān)分子起著重要功能，它們一般被稱為癌基因和抑癌基因[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，將抑癌基因轉(zhuǎn)入到靶部，可以遏止靶細(xì)胞的增殖、侵襲能力并促進(jìn)凋亡，進(jìn)而達(dá)到醫(yī)治疾病的目的。

FABP-5 是一種高度同源的小分子胞內(nèi)蛋白，是脂結(jié)合蛋白族的一員，由 126 ~ 134 個(gè)氨基酸構(gòu)成，對(duì)酸有較高的附和力，在肝類中含量高，普遍排布于脂肪、腦、腸、心、骨骼肌等組織中[15-16]。FABP 的配體分布很廣，包含長(zhǎng)鏈脂肪酸等，也可與肝臟中數(shù)量較多的視黃醛衍生物和視黃基棕櫚酸相結(jié)合[17-19]。FABP 擔(dān)當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸任務(wù)，而肝臟是脂質(zhì)生成和利用的關(guān)鍵部位，其與脂肪酸結(jié)合后，可以大大增加脂肪酸的可溶性，也可進(jìn)到胞核內(nèi)顯示其潛在的調(diào)節(jié)功效，是維持肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要因素[20-21]。因此，F(xiàn)ABP 對(duì)肝脂質(zhì)代謝的調(diào)控功能具有明顯的影響[22]。有研究表明，F(xiàn)ABP-5 基因沉默后，人肝癌細(xì)胞侵襲力降低，細(xì)胞周期阻滯于 G2/M 期，胞細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞增殖受到抑制，表明 FABP-5 基因有可能成為肝癌基因治療的新靶點(diǎn)[23]。本研究將siRNA 敲減后的 FABP-5 基因轉(zhuǎn)入人肝癌 Bel-7402 細(xì)胞中，以觀測(cè)其對(duì)肝癌 Bel-7402 增殖的下調(diào)作用。

人參皂苷（Rh2）是從中國(guó)傳統(tǒng)中藥人參和三七中提取出的 Rh2 類單體之一，是一種固醇類化合物。Rh2 具備調(diào)節(jié)微循環(huán)、阻礙鈣離子內(nèi)向流動(dòng)、下調(diào)炎性等多種效應(yīng)。有研究表明，人參皂苷能夠通過激活 MAPK 通路抑制肝癌細(xì)胞的遷移，可能通過 DR4、DR5 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[24-25]。而川芎嗪能夠促進(jìn) p53 蛋白的表達(dá)，抑制 Bcl-2 蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的增殖[26]。人參川穹嗪具有以上成分，能夠協(xié)同起到抗肝癌的效果。

本研究通過RT-PCR 和 Western blot 檢測(cè) FABP-5 分子及蛋白的表達(dá)，通過流式細(xì)胞儀、CCK8 法、細(xì)胞侵襲小室法，檢測(cè)FABP-5 對(duì) Bel-7402 細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲作用的影響。一系列結(jié)果均表明，在人肝癌 Bel-7402 中敲減 FABP-5 后，促進(jìn)了肝癌 Bel-7402 的凋亡，下調(diào)了其增殖、侵襲的能力。這說明從分子生物學(xué)方面著手研究，轉(zhuǎn)入抑癌分子到靶部，能夠起到下調(diào)靶細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

綜上所述，下調(diào)癌性細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡是控制腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

探尋信號(hào)通路中對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用的調(diào)控因子，以彌補(bǔ)因基因缺失與突變所誘發(fā)的病癥，針對(duì)相關(guān)基因找到靶向阻斷藥物，將可能成為治療惡性腫瘤的重要思路和策略。本研究為體外人肝癌 Bel-7402 轉(zhuǎn)入靶向 FABP-5 分子的 RNA 干擾技術(shù)的可行性提出了研究依據(jù)。但目前關(guān)于FABP-5 與肝癌的關(guān)系、確切的凋亡機(jī)制尚未確定，還需更深入的探究。

[1] Zhu LQ, Cao J, Lu XX, et al. Cross-species comparison of Smad3 expression in hepatocellular carcinoma tissues. Chin J Pathophysiology,2013, 29(1):70-75. (in Chinese)

朱伶群, 曹驥, 盧曉旭, 等. 跨種屬研究Smad3在肝癌組織中的表達(dá)及意義. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(1):70-75.

[2] Yang Z, Zhou L, Wu LM, et al. Overexpression of long non-coding RNA HOTAIR predicts tumor recurrence in hepatocellular carcinoma patients following liver transplantation. Ann Surg Oncol, 2011, 18(5): 1243-1250.

[3] Bi L, Yan XJ, Yang Y, et al. Optimization of effective component formula of salviae miltiorrhizae radix et rhizoma and ginseng radix et rhizoma on hepatoma carcinoma using orthogonal design. Chin J Exp Traditional Med Formulae, 2015, 21(13):82-86. (in Chinese)

畢蕾, 顏曉靜, 楊燁, 等. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選丹參-人參組分抗肝癌配伍研究. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015, 21(13):82-86.

[4] Thun MJ, DeLancey JO, Center MM, et al. The global burden of cancer: priorities for prevention. Carcinogenesis, 2010, 31(1):100-110.

[5] Liang HJ, Wei W, Kang XN, et al. Differentially expressed proteins in the precancerous stage of rat hepatocarcinogenesis induced by diethylnitrosamine. Chin J Hepatol, 2009, 17(9):669-674. (in Chinese)

梁宏潔, 韋薇, 康曉楠, 等. 二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌過程中癌前病變階段差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選. 中華肝臟病雜志, 2009, 17(9): 669-674.

[6] Zhou LL, Cao J, Li W, et al. Effect of RNA interference targeting FABP-5 on cell proliferation, apoptosis and invasion in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2. World Chin J Digestology, 2015, 23(2):179-188. (in Chinese)

周玲麗, 曹驥,李薇, 等. 沉默F(xiàn)ABP-5基因?qū)θ烁伟〩epG2細(xì)胞的影響. 世界華人消化雜志, 2015, 23(2):179-188.

[7] Liu Q, Wang SF, Xu H, et al. Expressions and significances of CRABPII and E-FABP in non-small cell lung cancer. Chin J Lung Cancer, 2013, 16(1):12-19. (in Chinese)

劉倩, 王世鳳, 徐緩, 等. CRABPII和E-FABP在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義. 中國(guó)肺癌雜志, 2013, 16(1):12-19.

[8] Thumser AE, Moore JB, Plant NJ. Fatty acid binding proteins: tissue-specific functions in health and disease. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2014, 17(2):124-129.

[9] Shi JL, Cao J, Su JJ, et al. Expression of epidermal fatty acid-binding protein in cross-species hepatocellular carcinoma. Chin J Hepatol, 2012, 20(4):270-274. (in Chinese)

史俊林, 曹驥, 蘇建家, 等. 表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白在跨種屬肝癌組織中的表達(dá). 中華肝臟病雜志, 2012, 20(4):270-274.

[10] El-Serag HB. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med, 2011, 365(12): 1118-1127.

[11] Vivarelli M, Risaliti A. Liver transplantation for hepatocellular carcinoma on cirrhosis: strategies to avoid tumor recurrence. WorldJ Gastroenterol, 2011, 17(43):4741-4746.

[12] Lu XX, Cao J, Li Y, et al. Expression of Cdc25a in cross-species hepatocellular carcinoma tissues and its significance. ChinJ Pathophysiology, 2014, 30(5):820-824. (in Chinese)

盧曉旭, 曹驥, 李瑗, 等. Cdc25a在跨種屬肝癌組織中的表達(dá)及其意義. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(5):820-824.

[13]Xie Y, Dai JG. Study on mechanism of TCM treatment of primary liver cancer. J Changchun Univ Traditional Chin Med, 2011, 27(5): 738-740. (in Chinese)

謝益, 戴建國(guó). 原發(fā)性肝癌的中醫(yī)藥治療機(jī)制研究. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 27(5):738-740.

[14] Chen HY, Lang QB, Yue XQ, et al. Initial analysis on affects and factors of therapeutic prescription with Chinese drugs upon post-operation recurrence of hepatocarcinoma. Jilin J Traditional Chin Med, 2011, 31(7):636-638. (in Chinese)

陳紅云, 郎慶波, 岳小強(qiáng), 等. 中藥治療方案對(duì)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素初步分析. 吉林中醫(yī)藥, 2011, 31(7):636-638.

[15] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

[16] Jeong CY, Hah YS, Cho BI, et al. Fatty acid-binding protein 5 promotes cell proliferation and invasion in human intrahepatic cholangiocarcinoma. Oncol Rep, 2012, 28(4):1283-1292.

[17] Fang LY, Wong TY, Chiang WF, et al. Fatty-acid-binding protein 5 promotes cell proliferation and invasion in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, 2010, 39(4):342-348.

[18] Shi JL, Cao J, Su JJ, et al. Clinical significance of upregulated expression of epidermal fatty acid binding protein in hepatocellular carcinoma tissues from different species. World Chin J Digestology, 2013, 21(11):963-969. (in Chinese)

史俊林, 曹驥, 蘇建家, 等. 表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白在不同種屬肝癌組織中的高表達(dá)及其臨床意義. 世界華人消化雜志, 2013, 21(11):963-969.

[19] Li J, Xu LZ. Protective effect of chuanhunzine injection on acute alcoholic liver injury in mice. J Huaihai Med, 2015, 33(3):250-252. (in Chinese)

李甲, 徐凌忠. 川穹嗪注射液對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用觀察. 淮海醫(yī)藥, 2015, 33(3):250-252.

[20] Storch J, Thumser AE. Tissue-specific functions in the fatty acid-binding protein family. J Biol Chem, 2010, 285(43):32679- 32683.

[21] Diao JS, Zhang X, Guo SZ. Progression of epidermal fatty acid binding protein. J Int Pathol Clin Med, 2009, 29(1):50-53. (in Chinese)

刁建升, 張曦, 郭樹忠. 表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展. 國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志, 2009, 29(1):50-53.

[22] Armstrong EH, Goswami D, Griffin PR, et al. Structural basis for ligand regulation of the fatty acid-binding protein 5, peroxisome proliferator-activated receptor β/δ (FABP5-PPARβ/δ) signaling pathway. J Biol Chem, 2014, 289(21):14941-14954.

[23] Zhou LL. Effect of silencing FABP-5 gene by RNA interference on the growth of HepG2 human hepatoma and xenografts in nude mice. Nanning: Guangxi Medical University, 2015. (in Chinese)

周玲麗. RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)ABP-5基因?qū)θ烁伟〩epG2細(xì)胞和裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響. 南寧: 廣西醫(yī)科大學(xué), 2015.

[24] Feng ZQ, Zuo GW, Shi QQ, et al. Mechanism of ginsenoside Rh2 inhibiting HepG2 cells migration. Chin J Immunol, 2015, 31(1):61-65. (in Chinese)

馮子強(qiáng), 左國(guó)偉, 石慶強(qiáng), 等. 人參皂苷Rh2抑制肝癌HepG2細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2015, 31(1):61-65.

[25] Fan J, Zhang L, Wang X. Effect of ginsenoside Rk3 on apoptosis of HepG2. Acta Univ Med Anhui, 2016, 51(11):1604-1607, 1608. (in Chinese)

范潔, 張磊, 王嘯. 人參皂苷Rk3對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 51(11):1604-1607, 1608.

[26] Feng QF, Bi L, Yan XJ, et al. Effect of tetramethypyrazine onapoptosis of HepG2 cells and expression of associated protein.J Nanjing Univ Traditional Chin Med, 2015, 31(3):246-249. (in Chinese)

馮全服, 畢蕾, 顏曉靜, 等. 川芎嗪調(diào)控肝癌 HepG2細(xì)胞凋亡及對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 31(3):246- 249.

The effect of FABP-5 gene silencing on the biological characteristics and the sensitivity of Ginseng ligustrazine in human hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells

LI Jia

Author Affiliation: Digestive Department of Liaoning Electric Power Center Hospital, Shenyang 110016, China

To investigate the siRNA silencing epidermal fatty acid binding protein-5 (FABP-5) gene expression in human hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells and the sensitivity of Ginseng ligustrazine.

The interference siRNA sequence was designed and synthesized according to the FABP-5 sequence of mRNA, and then transiently transfected into human hepatoma cell line Bel-7402 cells. The cells were divided into 3 groups: FABP-5 siRNA group, negative control group and blank control group. RT-PCR and Western blot method were used to detect the expression of FABP-5 gene at mRNA and protein level. Cell proliferationwas determined by CCK8 method. Flow cytometry was applied to examine periodic change of the cells of each group and cell apoptosis. Cell invasion was detected with transwell inserts. Each experiment was repeated 3 times. The sensitivity of Ginseng ligustrazine to Bel-7402 cells was observed with MTT assay after FABP-5 gene silencing.

The results from RT-PCR and Western blot showed that the mRNA of FABP-5 or protein in FABP-5 siRNA group was significantly lower than that in negative control group and blank control group. The growth rate of cells in siRNA group was significantly decreased, cell cycle was arrested in G0/G1phase, and S phase cells decreased. As compared to the negative control group or blank control group, the apoptosis of cells in FABP-5 siRNA group was significantly increased (< 0.01) and proliferation or invasion ability decreased significantly (< 0.05). The sensitivity of Ginseng ligustrazine in FABP-5 siRNA group cells increased significantly (< 0.05).

The expression of FABP-5 gene reduces the invasion ability of hepatocellular carcinoma cells, inhibits the proliferation of cells, blocks the cell cycle in G0/G1phase, and increases the apoptosis.

Fatty acid-binding proteins; RNA interference; Liver neoplasms; Cell cycle; Apoptosis; Bel-7402 cells; Ginseng ligustrazine

LI Jia, Email: lijiaxhnk@163.com

2017-09-13

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.009