季宇彬，孫瑩，張青揚(yáng)，王慶華，胡海宇

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新型孔雀石綠衍生物的合成及其生物活性研究

季宇彬，孫瑩，張青揚(yáng)，王慶華，胡海宇

150076 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心（季宇彬、孫瑩）；100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)與適藥化研究北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張青揚(yáng)、王慶華、胡海宇）

以孔雀石綠（MG）為先導(dǎo)化合物，對(duì)其 C 環(huán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造及修飾，系統(tǒng)評(píng)價(jià)合成的MG 類似物的抗致病菌 ESKAPE 活性及細(xì)胞毒性。

以芳香醛為原料，經(jīng)過縮合、氧化反應(yīng)得到13 個(gè) MG 類似物，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H-NMR、13C-NMR 和 HRMS 確證。采用肉湯微量稀釋法測定目標(biāo)化合物抗致病菌 ESKAPE 的最小抑菌濃度（MIC），用細(xì)胞增殖法（MTS）測試目標(biāo)化合物的毒性。

孔雀石綠及其 C 環(huán)改造類似物普遍對(duì)革蘭陽性菌有抑制作用，而對(duì)革蘭陰性菌無作用。其中 3b 對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌活性（MIC = 0.39 μmol/L）是 MG（MIC =1.56 μmol/L）的 4 倍；3f比 MG 的細(xì)胞毒性降低 10 倍以上。

設(shè)計(jì)、合成了 13 種新型孔雀石綠衍生物，并對(duì)其進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)，從中篩選出了抑菌活性高于孔雀石綠的化合物，為研制新型抗致病菌ESKAPE的藥物提供了基礎(chǔ)。

ESKAPE； 孔雀石綠； 抗菌活性； 細(xì)胞毒性

細(xì)菌感染已成為嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，特別是耐藥菌的出現(xiàn)，已成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)的一個(gè)棘手難題。新型抗生素的研發(fā)是全球藥物研究領(lǐng)域的重要方向。目前，存在 6 種耐藥性嚴(yán)峻的細(xì)菌，稱為 ESKAPE 病原菌，分別是屎腸球菌（）、金黃色葡萄球菌（）、肺炎克雷伯菌（）、鮑曼不動(dòng)桿菌（）、銅綠假單胞菌（）及腸桿菌屬（）[1-2]。在全球范圍內(nèi)，ESKAPE 耐藥已成為導(dǎo)致患者發(fā)病及死亡的重要原因之一[3-4]。因此，探索開發(fā)新型 ESKAPE 抑制藥物具有重要的意義。

孔雀石綠（malachite green，MG）是一種人工合成的-甲基化二氨基三苯基甲烷類染料，化學(xué)式為 C23H25ClN2，結(jié)構(gòu)式見圖 1[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠具有抗菌活性，其對(duì)防治水霉病等有特效，因此，許多國家將其用作水產(chǎn)養(yǎng)殖中的殺菌劑[8]。文獻(xiàn)報(bào)道 MG 主要通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)抗菌，一種為抑制 mRNA 與核糖體的結(jié)合，另一種為抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶 II 的功能[9]。但對(duì)其系統(tǒng)的抗菌活性及抗菌譜研究尚未見報(bào)道。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸作用[10-11]。其毒性作用機(jī)制之一是通過嵌入 DNA 生成加合物，抑制人體谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，造成脂質(zhì)過氧化，使細(xì)胞凋亡[12]。

圖 1 孔雀石綠結(jié)構(gòu)式

Figure 1 Structural formula of malachite green

本文首次對(duì) MG 抗病原菌 ESKAPE 能力進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，而后以 MG 為先導(dǎo)化合物，對(duì)其 C 環(huán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造及修飾，設(shè)計(jì)、合成 13 個(gè) MG 類似物，并對(duì)此類化合物進(jìn)行了系統(tǒng)的抗病原菌 ESKAPE 的活性及其細(xì)胞毒性研究，初步探索了構(gòu)效關(guān)系，為后續(xù)研發(fā)具有更好抑菌活性及低毒性的新型抗致病菌ESKAPE藥物提供一定的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌（ATCC 33592）、糞腸球菌（CICC 10840）、屎腸球菌（ATCC 29212）、表皮葡萄球菌（ATCC 12228）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、鮑曼不動(dòng)桿菌（CICC 22933）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、陰溝腸桿菌（ATCC 13047）、大腸埃希菌（ATCC 25922）均購自美國菌種保藏中心（ATCC）或中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；枯草芽孢桿菌（CTCC 63501）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所朱平研究員課題組提供。

1.1.2 主要儀器及試劑 ECZ-400MHz 和 ECZ-500MHz 型核磁共振儀為日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品；Avance-III HD-600MHz 型核磁共振儀為德國 Bruker 公司產(chǎn)品；Exactive plus 型液質(zhì)聯(lián)用儀和 Nicolet 6700 型傅立葉紅外光譜儀為美國 Themo Fisher 公司產(chǎn)品；MP-J3 型熔點(diǎn)儀為日本 Yanaco 公司產(chǎn)品；Tecan SparkTM型酶標(biāo)儀為瑞士 Tecan 公司產(chǎn)品；所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)化合物的合成 以芳香醛為原料，在 Lewis 酸作用下與,-二甲基苯胺縮合得到中間體 2，隨后中間體 2 與四氯苯醌在乙酸乙酯條件下發(fā)生氧化反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物。對(duì)收率影響最大的是第一步縮合反應(yīng)，本文以中間體 2a 為例，采用不同的 Lewis 酸和溶劑（圖 2）對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行探索，以尋找高收率、低成本、后處理簡便的反應(yīng)路線。

1.2.2 抑菌活性測試 參照 CLSI 標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)[13]。試驗(yàn)菌用 MH 肉湯增菌，藥液用 MH 肉湯二倍稀釋成各種所需濃度于 96 孔板中，每孔 100 μl。各孔中藥液的終濃度分別為 100、50、25…… 0.390625 和 0.1953125 μmol/L。依次接種試驗(yàn)菌（接種量約為5 × 105CFU/ml），置 37 ℃恒溫培養(yǎng) 18 h 后觀察結(jié)果，無菌生長的孔中所含藥物最小的濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 利用 MTS 法對(duì) 13 個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行細(xì)胞活性評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)的細(xì)胞有大鼠成肌細(xì)胞 L6、人腎上皮細(xì)胞 293A、小鼠巨噬細(xì)胞 Raw 264.7 和人肝癌細(xì)胞 HepG2。在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液，100 μl/孔，細(xì)胞密度為 3 × 104個(gè)/ml，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁后用5 個(gè)濃度梯度的目標(biāo)化合物處理，并設(shè)陰性對(duì)照組（加入空白溶劑），在上述條件下培養(yǎng) 72 h，加入 MTS 溶液（1.90 mg/ml）20 μl，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀 490 nm 處測得吸光度值，計(jì)算 IC50。

圖 2 中間體 2a 合成反應(yīng)條件的優(yōu)化

Figure 2 Optimization of reaction conditions

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)化合物的合成

研究發(fā)現(xiàn)，選用相對(duì)弱的 Lewis 酸（無水 ZnCl2）和無溶劑的條件時(shí)，收率較高，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，后處理簡便，具有綠色化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。通過兩步反應(yīng)合成目標(biāo)化合物 3a ~ 3m，共計(jì) 13 個(gè)（圖3）。結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H-NMR、13C-NMR 和 HRMS 確證。

2.1.1 4-[(4--二甲基苯基)(6-喹啉)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3a） 深綠色固體，收率 61.5%，mp：128 ~ 130 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：9.06（s，1H，-Ar），8.40（d，= 8.4 Hz，1H，-Ar），8.24（d，= 8.8 Hz，1H，-Ar），7.93（s，1H，-Ar），7.62（d，= 8.8 Hz，1H，-Ar），7.59（t，= 8.4 Hz，1H，-Ar），7.40（d，= 9.2 Hz，4H，-Ar），6.99（d，= 9.2 Hz，4H，-Ar），3.39（s，12H，-CH3）；13C-NMR（151 MHz，CDCl3）：175.03，156.88，140.60，139.62，138.22，135.67，135.59，131.91，128.94，128.25，127.06，127.00，114.05，41.23。IR（KBr）：2923，2857（C-H），1681（C=N），1610，1581，1477，1456（C=C），831，728（C-H）cm-1。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值 C26H26N3+：380.2120，測定值 380.2121。

圖 3 化合物 3a ~ 3m 的合成路線（A：N,N-二甲基苯胺，氯化鋅，100 ℃，過夜；B：四氯苯醌，乙酸乙酯，80 ℃，8 h）

Figure 3 Synthetic routes of 3a ~ 3m (A:,-dimethylaniline, ZnCl2, 100℃, overnight; B: Tetrachloro--benzoquinone, ethylacetate, 80 ℃, 8 h)

2.1.2 4-[(4--二甲基苯基)(4-溴苯基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3b） 深綠色固體，收率 76.5%，mp：148 ~ 150 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：7.68（d，= 8.0 Hz，2H，-Ar），7.52（d，= 8.8 Hz，1H，-Ar），7.35（d，= 9.2 Hz，4H，-Ar），7.19（d，= 8.0 Hz，1H，-Ar），6.98（d，= 9.2 Hz，4H，-Ar），3.38（s，12H，-CH3）；13C-NMR（151 MHz，CDCl3）：175.03，156.88，140.60，139.62，138.22，135.67，135.59，131.91，128.94，128.25，127.06，127.00，114.05，41.23。IR（KBr）：2921，2851（C-H），1615，1582，1476（C=C），834（C-H）cm-1。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值 C23H24N2Br+：407.1119，測定值 407.1117。

2.1.3 4-[(4--二甲基苯基)(4-(4-乙氧基-4-氧代丁氧基)苯基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3c） 深綠色固體，收率 69.2%，mp：151 ~ 153 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：7.36（d，= 8.8 Hz，4H，-Ar），7.30（d，= 8.8 Hz，2H，-Ar），7.06（d，= 8.8 Hz，2H，-Ar），6.95（m，= 9.2 Hz，4H，-Ar），4.17（m，4H，-CH2-），3.56（s，12H，-CH3），2.56（t，= 7.2 Hz，2H，-CH2-），2.20（m，2H，-CH2-），1.28（t，= 7.2 Hz，3H，-CH3）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：178.03，173.24，164.23，156.81，143.70，140.92，137.93，131.93，127.44，119.57，115.11，113.82，67.70，60.83，41.36，30.80，24.58，14.47。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值 C29H35O3N2+：459.2642，測定值 459.2631。

2.1.4 4-[(4--二甲基苯基)(1-(4-乙氧基-4-氧代丁氧基)萘基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3d） 紫色固體，收率 90.5%，mp：111 ~113 ℃；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：8.35（d，= 8.4 Hz，1H，-Ar），7.47（d，= 8.0 Hz，1H，-Ar），7.38 ~ 7.34（m，4H，-Ar），7.31（m，2H，-Ar），6.96（m，2H，-Ar），6.9（d，= 8.8 Hz，4H，-Ar），4.36 ~ 4.33（t，= 6.0 Hz，2H，-CH2-），4.21 ~ 4.16（m，2H，-CH2-），3.35（s，12H，-CH3），2.68 ~ 2.65（t，= 7.2 Hz，2H，-CH2-），2.37 ~ 2.31（m，2H，-CH2-），1.28（t，= 7.2 Hz，3H，-CH3）。13C-NMR（150 MHz，CDCl3）：176.0，173.0，158.9，156.8，143.5，140.2，136.0，134.9，129.9，128.5，128.1，126.1，125.9，125.6，122.6，119.3，113.8，104.2，67.7，60.6，41.1，30.9，24.5，14.2。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值C33H37O3N2+：509.2799，測定值509.2796。

2.1.5 4-[(4--二甲基苯基)(4-(4-乙氧基-4-氧代丁基)一氫吲哚基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3e） 紫色固體，收率 80%，mp：107 ~ 109 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：7.69 ~ 7.67（d，= 8.0 Hz，1H，-Ar），7.41 ~ 7.39（d，= 8.8 Hz，4H，-Ar），7.35 ~ 7.31（m，1H，-Ar），7.14 ~ 7.13（m，1H，-Ar），7.06 ~ 7.04（m，1H，-Ar），6.91 ~ 6.89（d，= 8.8 Hz，4H，-Ar），5.77（d，= 2.8 Hz，1H，-Ar），4.29 ~ 4.25（t，= 7.2 Hz，2H，-CH2-），4.18 ~ 4.11（m，2H，-CH2-），3.35（s，12H，-CH3），2.38 ~ 2.34（m，2H，-CH2-），2.22 ~ 2.18（m，2H，-CH2-），1.27（t，= 7.2 Hz，3H，-CH3）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：177.89，172.95，156.89，140.92，136.38，131.84，131.78，130.60，128.71，127.86，121.38，115.05，113.67，101.85，60.95，45.89，41.36，31.28，25.71，14.46。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值C31H36O2N3+：482.2802，測定值 482.2795。

2.1.6 4-[(4--二甲基苯基)(3-(4-乙氧基-4-氧代丁基)一氫吲哚基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3f） 紫色固體，收率 66.7%，mp：102 ~ 104 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：8.14（s，1H，-Ar），7.63 ~ 7.61（d，= 9.2 Hz，1H，-Ar），7.47 ~ 7.45（m，4H，-Ar），7.38 ~ 7.34（m，1H，-Ar），7.18 ~ 7.12（m，2H，-Ar），6.86 ~ 6.83（m，4H，-Ar），4.68 ~ 4.64（t，= 7.2 Hz，2H，-CH2-），4.12 ~ 4.06（m，2H，-CH2-），3.25（s，12H，-CH3），2.54 ~ 2.50（m，2H，-CH2-），2.33 ~ 2.30（m，2H，-CH2-），1.21（t，= 7.2 Hz，3H，-CH3）。13C-NMR（150 MHz，CDCl3）：172.80，172.31，155.65，144.61，139.20，138.65，128.58，125.10，123.72，121.27，119.18，112.58，111.81，60.67，47.22，40.60，30.99，25.03，14.16。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值 C31H36O2N3+：482.2802，測定值 482.2793。

2.1.7 4-[(4--二甲基苯基)(3-(5-溴-1-(4-乙氧基- 4-氧代丁基))一氫吲哚基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3g） 紫色固體，收率 74%，mp：128 ~ 130 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：8.21（s，1H，-Ar），7.55 ~ 7.53（d，= 8.4 Hz，1H，-Ar），7.44 ~ 7.42（m，5H，-Ar），7.22（m，1H，-Ar），6.86 ~ 6.83（m，4H，-Ar），4.69 ~ 4.66（t，= 7.6 Hz，2H，-CH2-），4.10 ~ 4.05（m，2H，-CH2-），3.26（s，12H，-CH3），2.54 ~ 2.50（m，2H，-CH2-），2.30 ~ 2.26（m，2H，-CH2-），1.21（t，= 7.2 Hz，3H，-CH3）。13C-NMR（150 MHz，CDCl3）：172.86，171.70，155.93，144.89，139.32，137.30，130.08，127.79，123.71，119.71，117.88，117.12，113.32，112.74，60.65，47.28，40.64，30.90，25.05，14.16。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值C31H35O2N3Br+：560.1907，測定值 560.1902。

2.1.8 4-[(4--二甲基苯基)(4-喹啉)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3h） 深綠色固體，收率 83.7%，mp：130 ~ 132 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：9.06 ~ 9.05（m，1H，-Ar），8.25 ~ 8.24（d，= 8.5 Hz，1H，-Ar），7.78 ~ 7.75（m，1H，-Ar），7.48 ~ 7.46（m，1H，-Ar），7.45 ~ 7.38（m，4H，-Ar），7.31 ~ 7.30（m，2H，-Ar），6.99 ~ 6.97（m，4H，-Ar），3.40（s，12H，-CH3）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：169.12，157.22，149.55，148.45，145.83，143.86，139.92，137.60，130.53，130.20，128.33，27.68，127.39，125.75，124.13，119.84，114.94，112.89。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值 C26H26N3+：380.2121，測定值 380.2121。

2.1.9 4-[(4--二甲基苯基)(4-((4-乙酰氨基苯基)乙炔基)苯基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3i） 深綠色固體，收率 86.2%，mp：158 ~ 160 ℃。1H-NMR（400 MHz，Methanol-d）：7.72（d，= 8.4 Hz，2H，-Ar），7.66（d，= 8.8 Hz，2H，-Ar），7.53（d，= 8.8 Hz，2H，-Ar），7.46（d，= 9.6 Hz，4H，-Ar），7.41（d，= 8.8 Hz，2H，-Ar），7.09（d，= 9.6 Hz，4H，-Ar），3.36（s，12H，-CH3），2.17（s，3H，-CH3）。13C-NMR（151 MHz，Methanol-d）：177.37，171.61，158.40，145.52，141.67，140.83，140.40，135.88，133.35，132.27，129.61，128.25，121.33，120.62，118.72，114.72，94.65，88.93，40.83，23.82。IR（KBr）：2928，2859（C-H），1679（C=O），1615，1582，1522，1476（C=C），1168（C-O-C），836（C-H）cm-1。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值 C33H32N3O+：486.2527，測定值 486.2540。

2.1.10 4-[(4--二甲基苯基)(2-萘基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3j） 深綠色固體，收率 91.8%，mp：165 ~ 167 ℃。1H-NMR（500 MHz，Methanol-d）：8.04（t，= 8.0 Hz，2H，-Ar），7.98（d，= 8.5 Hz，1H，-Ar），7.94（s，1H，-Ar），7.72（t，= 7.5 Hz，1H，-Ar），7.64（t，= 8.0 Hz，1H，-Ar），7.47（d，= 9.0 Hz，4H，-Ar），7.44（d，= 8.5 Hz，1H，-Ar），7.07（d，= 9.0 Hz，4H，-Ar），3.35（s，12H，-CH3）。13C-NMR（151 MHz，Methanol-d）：178.98，158.39，141.88，138.41，137.50，136.67，133.82，131.19，130.33，130.15，129.11，128.82，128.63，128.41，114.67，40.80。IR（KBr）：2925，2859（C-H），1613，1581，1476，1434（C=C），829，758（C-H）cm-1。HRMS （m/z）（M+）：計(jì)算值 C27H27N2+：379.2159，測定值 379.2169。

2.1.11 4-[(4--二甲基苯基)(2,4,6-三溴-3-羥基苯基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3k） 深綠色固體，收率 77.5%，mp：195 ~197 ℃。1H-NMR（400 MHz，Methanol-d）：7.91（s，1H，-Ar），7.47（d，= 9.2 Hz，4H，-Ar），7.03（d，= 9.6 Hz，4H，-Ar），3.33（s，12H，-CH3）。13C-NMR（151 MHz，Methanol-d）：171.42，158.37，141.39，140.29，136.23，126.37，115.68，114.94，114.37，41.01，30.62。IR（KBr）：2921，2851（C-H），1615，1582，1476（C=C），828，797，717（C-H）cm-1。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值 C23H22ON2Br3+：578.9265，測定值 578.9277。

2.1.12 4-[(4--二甲基苯基)(4-羥基苯基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3l） 深綠色固體，收率 75%，mp：147 ~ 149 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：7.45（d，= 8.8 Hz，2H，-Ar），7.35（d，= 8.8 Hz，4H，-Ar），7.18（d，= 8.8 Hz，2H，-Ar），6.84（d，= 8.8 Hz，4H，-Ar），3.29（s，12H，-CH3）。13C-NMR（151 MHz，CDCl3）：180.86，167.79，156.12，141.04，140.66，139.17，129.33，126.91，117.85，113.30，112.54，40.86，40.63。IR（KBr）：2921，2853（C-H），1581，1471（C=C），826（C-H）cm-1。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值C23H25ON2+：345.1963，測定值 345.1961。

2.1.13 4-[(4--二甲基苯基)(4-(2-羧基乙烯基)苯基)]亞甲基-2,5-環(huán)己二烯基-1--二甲基氯化胺（3m） 深綠色固體，收率 83.2%，mp：180 ~182 ℃。1H-NMR（400 MHz，Methanol-d）：7.84（d，= 8.0 Hz，2H，-Ar），7.79（d，= 16 Hz，1H，-CH-），7.44（d，= 9.6 Hz，6H，-Ar），7.07（d，4H，= 9.6 Hz，-Ar），6.70（d，= 16 Hz，1H，-CH-），3.35（s，12H，-CH3）。13C-NMR（151 MHz，Methanol-d）：177.30，169.51，158.46，144.22，142.40，141.69，140.23，136.19，129.04，128.31，122.57，114.76，40.83，30.62。IR（KBr）：3364（-OH），2920，2851（C-H），1703（C=O），1615，1582，1554，1478（C=C），836（C-H）cm-1。HRMS（m/z）（M+）：計(jì)算值C26H27O2N2+：399.2067，測定值399.2069。

2.2 抗菌活性評(píng)價(jià)

以 MG 作為對(duì)照，將合成的 13 個(gè) MG 類似物分別進(jìn)行抗致病菌活性評(píng)價(jià)，得到最小抑菌濃度（MIC）（表1）。測試細(xì)菌包括致病菌 ESKAPE 及糞腸球菌（），枯草芽孢桿菌（），表皮葡萄球菌（），大腸埃希菌（），其中金黃色葡萄球菌（ATCC 33592）為耐藥菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MG 類化合物普遍對(duì)革蘭陽性菌有抑制作用，而對(duì)革蘭陰性菌無抑制作用。與先導(dǎo)化合物 MG 相比，設(shè)計(jì)合成的 13 個(gè) MG 類似物中，3a和 3c 的抑菌活性與 MG 基本相當(dāng)，3d ~ 3j 的抑菌活性相比 MG 略低；而 3m 基本無抑菌活性，其原因可能為 3m 引入的羧基為親水性基團(tuán)，降低了化合物的脂溶性，使其不易進(jìn)入細(xì)菌，抑菌活性降低。值得一提的是化合物 3b 對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌活性得到了明顯的提高，是 MG 的 4 倍以上。

2.3 細(xì)胞毒性測試

我們對(duì) MG 及設(shè)計(jì)合成的 13 個(gè) MG 類似物分別進(jìn)行細(xì)胞 MTS 試驗(yàn)。選擇 4 種細(xì)胞，其中包括 3 種正常細(xì)胞和 1 種癌細(xì)胞。正常細(xì)胞分別為大鼠成肌細(xì)胞（L6）、人腎上皮細(xì)胞（293A）和小鼠巨噬細(xì)胞（Raw 264.7）；癌細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞（HepG2），結(jié)果見表2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)比每種細(xì)胞的 IC50值，發(fā)現(xiàn)除 3i、3j 毒性與 MG 基本相同外，其余化合物的 IC50值均有提高。3a、3b 的 IC50值大約是 MG 的 2 倍；3c ~ 3e 的IC50值則是 MG 的 4 倍左右；3f ~ 3h 和 3k ~ 3m 的毒性均低于 MG，但相比于3f ~ 3h，3k ~ 3m 的抑菌能力較差。因此在保證抑菌能力的情況下含有吲哚或喹啉環(huán)的 3f ~ 3h 毒性最低，其中 3f 的 IC50值是 MG 的 10 倍以上。結(jié)果表明在結(jié)構(gòu)中引入芳香雜環(huán)或雜原子基團(tuán)時(shí)，毒性得到顯著降低。

表 1 化合物 3a ~ 3m 的抗菌活性（MIC）（μmol/L）

表 2 化合物 3a ~ 3m 的細(xì)胞毒性 IC50（μmol/L）

3 討論

本文以 MG 為先導(dǎo)化合物，對(duì)其 C 環(huán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造及修飾，設(shè)計(jì)并合成 13 個(gè) MG 類似物。在合成關(guān)鍵中間體 2 的過程中采用了綠色環(huán)保的無溶劑反應(yīng)策略，不僅后處理簡便，而且收率較高。系統(tǒng)評(píng)價(jià)該類化合物抗致病菌 ESKAPE 活性及細(xì)胞毒性表明，MG 類化合物作為抑菌劑，普遍對(duì)革蘭陽性菌有抑制作用，而對(duì)革蘭陰性菌無效。與先導(dǎo)化合物 MG 相比，化合物 3b 對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌活性提高了 4 倍以上。而除引入親水基團(tuán)的 3k ~ 3m 外，多數(shù)化合物的抑菌活性與 MG 相當(dāng)。因此，此類化合物的抗菌活性可能與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)，所以增強(qiáng)水溶性而降低了脂溶性導(dǎo)致其抑菌活性降低。再對(duì)比這些化合物的細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)，將 C 環(huán)替換為芳香雜環(huán)（吲哚或喹啉環(huán)）時(shí)，可以有效降低毒性，有可能是增大位阻不易嵌入 DNA 從而毒性降低。而引入鹵素或羧基等基團(tuán)時(shí)，毒性也得到明顯降低。其中化合物 3f 與 MG 具有類似抗菌活性但細(xì)胞毒性顯著降低，因而有待更深層次的研究。本文通過對(duì) MG 類化合物進(jìn)行抗菌活性和細(xì)胞毒性研究，初步探索了其構(gòu)效關(guān)系，為之后發(fā)現(xiàn)具有更好抗致病菌 ESKAPE 活性和更低毒性的藥物提供一定的借鑒意義。

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Synthesis and bioactivities of new malachite green derivatives

JI Yu-bin, SUN Ying, ZHANG Qing-yang, WANG Qing-hua, HU Hai-yu

Author Affiliations: School of Life and Environment Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China (JI Yu-bin, SUN Ying); State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Beijing Key Laboratory of Active Substance Discovery and Druggability Evaluation, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (ZHANG Qing-yang, WANG Qing-hua, HU Hai-yu)

In order to obtain more active antibacterial agents, 13 malachite green (MG) analogues were synthesized by modification the C ring of skeletal structure of MG. Biological activities of these MG analogues were evaluated in antibacterial pathogens assays and cytotoxicity assays.

Compounds were synthesized from aromatic aldehydes, via condensation reactions and oxidation reactions. The structure were confirmed by1H-NMR,13C-NMR and HRMS. The MICs of antibacterial activity was assayed by standard broth microdilution method. The cytotoxicity of the target compounds was tested by cellular proliferation (MTS).

Thirteen novel MG compounds were synthesized, among which some compounds were found to have anti-gram positive bacteria activity. Specifically, the activities of compound 3b (MIC = 0.39 μmol/L) againstwas four folds stronger than that of the lead compound MG (MIC = 1.56 μmol/L). The cytotoxicity of compound 3f was decreased by 10 times than that of the compound MG.

13 new malachite green derivatives were designed and synthesized. The biological activity were evaluated, and the compounds with higher antibacterial activity than malachite green were screened out, which provided the basis for the development of new anti-pathogenic bacteria "ESKAPE".

ESKAPE; Malachite green; Antimicrobial activity; Cytotoxicity

: WANG Qing-hua, Email: wangqinghua@imm.ac.cn; HU Hai-yu, Email: haiyu.hu@imm.ac.cn

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2017-I2M-2-004）

王慶華，Email：wangqinghua@imm.ac.cn；胡海宇，Email：haiyu.hu@imm.ac.cn

2017-11-03

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.006