劉 杰，吳曉龍

(1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004； 2.河南省漢帝藥業(yè)有限公司，河南 平頂山 467000)

五加皮酒由五加皮、陳皮、當(dāng)歸、川芎等26味中藥組成，具有舒筋活血、除濕祛風(fēng)功能，用于風(fēng)濕痹痛，手足痙攣，四肢麻木，腰膝酸痛[1]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀和常規(guī)檢查項(xiàng)目，不能滿足質(zhì)量控制的要求。本研究增加了五加皮酒中當(dāng)歸、川芎和獨(dú)活的薄層色譜鑒別法和主要成分橙皮苷的高效液相色譜含量測定法，以提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制本品質(zhì)量。

1 試藥與儀器

五加皮酒，由河南省漢帝藥業(yè)有限公司提供，批號20170101，20170102，20170103。橙皮苷，含量測定用，由中國藥品生物制品鑒定所提供，批號0721-200010。色譜純級甲醇；硅膠G，青島海洋化工廠產(chǎn)品。所用其他試劑均為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司產(chǎn)品，配備Waters 2696二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站；C-18柱(250 mm id×4.6mm，5μm，美國熱電公司產(chǎn)品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 當(dāng)歸和川芎的薄層色譜鑒別

按照《中國藥典》2015版通則0502薄層色譜法試驗(yàn)。取本品30 mL，用乙醚振搖提取2次(25，20 mL)，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，轉(zhuǎn)入小容量瓶，得供試品溶液。取當(dāng)歸、川芎對照藥材各0.5 g，分別加乙醚10 mL，超聲處理5 min，濾過，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，轉(zhuǎn)入小容量瓶，得對照藥材溶液。在同一用5 g/L羧甲基纖維素鈉水溶液制備的硅膠G薄層板上，分別點(diǎn)樣供試品溶液10 μL、當(dāng)歸和川芎對照藥材溶液各5 μL。展開劑為乙酸乙酯-正己烷(1∶9)，展開，晾干，于紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與2種對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。另取當(dāng)歸和川芎陰性對照樣品，同法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果：當(dāng)歸和川芎陰性對照樣品色譜中，在與兩種對照藥材色譜相應(yīng)的位置上沒有相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果表明：本法專屬性高。見圖1。

1～3.3批樣品；4.當(dāng)歸對照藥材；5.川芎對照藥材；6.當(dāng)歸和川芎陰性對照品圖1 當(dāng)歸和川芎的薄層色譜鑒別

2.1.2 獨(dú)活的鑒別

按《中國藥典》2015版通則0502薄層色譜法試驗(yàn)。供試品溶液采用2.1.1項(xiàng)下的同一種溶液。取蛇床子素對照品置小量瓶中，加甲醇使溶解，制成濃度為0.2 g/L的溶液作為對照品溶液。另取獨(dú)活對照藥材0.5 g，加甲醇10 mL，超聲提取10 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。在同一用5 g/L羧甲基纖維素鈉水溶液制備的硅膠G薄層板上，分別點(diǎn)樣供試品溶液10 μL、對照品溶液和對照藥材溶液各5 μL，展開劑為乙酸乙酯-石油醚(60～90 ℃) (3∶7)，展開后晾干，于紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。另取獨(dú)活陰性對照品同板進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果：陰性對照品的薄層色譜中，在與蛇床子素對照品和獨(dú)活對照藥材薄層色譜相應(yīng)的位置上，沒有相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果表明：該試驗(yàn)方法專屬性強(qiáng)，見圖2。

1～3.3批樣品；4.獨(dú)活對照藥材； 5.蛇床子素對照品；6.獨(dú)活陰性對照品圖2 獨(dú)活的薄層色譜鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 制備對照品溶液

取橙皮苷對照品適量，置25 mL容量瓶中，精密稱定為7.30 mg，加甲醇適量，超聲處理5 min使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，轉(zhuǎn)入10 mL量瓶中，加甲醇2 mL稀釋，再加水至刻度，搖勻，即得濃度為58.40 μg/L的橙皮苷對照品溶液。

2.2.2 制備供試品溶液

取本品濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 測定波長的選擇

對橙皮苷對照品色譜峰和樣品色譜中相應(yīng)的色譜峰提取二極管陣列檢測器光譜，結(jié)果：二者的紫外光譜吸收基本一致，均在285 nm處有強(qiáng)吸收，與《中國藥典》2015版陳皮項(xiàng)下規(guī)定的波長基本一致。故采用測定波長為283 nm。

2.2.4 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；檢測波長283 nm；流動相為甲醇-20 g/L乙酸水溶液(40∶60)。按《中國藥典》規(guī)定，理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

曾對比甲醇-20 g/L乙酸水溶液(37∶63)、甲醇-20 g/L 乙酸水溶液(42∶58)和甲醇-20 g/L乙酸水溶液(40∶60)3種流動相。結(jié)果：以甲醇-20 g/L乙酸水溶液(40∶60)色譜的保留時間和分離效果更滿意，故采用該流動相。

在此色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，計(jì)算。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取對照品溶液，依次精密進(jìn)樣2,5,10,15,20,25 μL，測定橙皮苷成分的峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)x，以峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得橙皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=1.314×103X-3.387×104，r=0.999 9。結(jié)果表明：橙皮苷進(jìn)樣量在 0.116 8～1.460 0 μg之間有良好的線性關(guān)系，直線近乎過原點(diǎn)。因此，可以采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行含量測定。

2.2.6 陰性對照試驗(yàn)

按制備工藝和處方比例，稱取除陳皮以外的各味藥材，制得陳皮陰性對照樣品。按供試品溶液制備方法，制得陳皮陰性對照溶液。分別吸取供試品溶液、橙皮苷對照品溶液和陰性對照溶液各10 μL，進(jìn)樣測定。結(jié)果：供試品色譜中在與對照品色譜相對應(yīng)的保留時間有色譜峰出現(xiàn)，而陰性對照溶液在相對應(yīng)位置無相應(yīng)的色譜峰。結(jié)果表明：本法專屬性強(qiáng)。見圖3。

a.五加皮酒；b.橙皮苷對照品；c.陳皮陰性對照品圖3 橙皮苷測定的HPLC色譜圖

2.2.7 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按2.2.4含量測定方法進(jìn)樣 6 次，以考察進(jìn)樣精密度。每次進(jìn)樣量為 10 μL，測定橙皮苷的峰面積。結(jié)果：平均值為539 950.7，RSD=0.4%(n=6)。結(jié)果表明：進(jìn)樣精密度良好。

2.2.8 供試液穩(wěn)定性

取同一供試液，考察 8 h 內(nèi)供試液的穩(wěn)定性。分別于0,1,2,4,6,8 h 時進(jìn)樣測定。結(jié)果：橙皮苷的峰面積平均值為542 343.4，RSD為 0.7%(n=6)。結(jié)果表明：供試液在 8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

對同一批號的樣品，過濾制備 6 份供試品溶液，按2.2.4含量測得法進(jìn)樣測定，各進(jìn)樣10 μL。結(jié)果：6 份供試液的橙皮苷成分的含量平均值為 0.04 398 g/L，RSD為 0.6%(n=6)。結(jié)果表明：本法的重復(fù)性良好。

2.2.10 定量限的測定

取橙皮苷對照品溶液，逐級稀釋后進(jìn)樣測定，直觀法測得定量限為 11.6ng。

2.2.11 回收率測定

精密量取已知含量的樣品 5 mL(含量為 0.043 98 g/L)，精密加入橙皮苷對照品溶液 4 mL(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.067g/L)，搖勻，即得加樣回收供試液，同法進(jìn)行測定，結(jié)果：平均加樣回收率為96.50%, RSD=1.28%(n=7)。見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.12 3批樣品含量測定

取五加皮酒樣品3批(批號依次為20170101，20170102，20170103)，按2.2.4含量測得法操作進(jìn)行測定。結(jié)果：3批樣品中的橙皮苷的含量依次為0.0439，0.0441和0.0442 g/L。

3 討 論

本品方中的主要藥味為五加皮和陳皮。由于五加皮沒有合適的含量測定指標(biāo)成分，故選取陳皮中的橙皮苷成分為含量測定的指標(biāo)成分。有關(guān)橙皮苷含量測定的研究報(bào)道較多。筆者按照《中國藥典》中陳皮的含量測定方法，采用高效液相色譜法測定方中橙皮苷成分[2-3]。有文獻(xiàn)[4]以高效液相色譜法測定五加皮酒中的橙皮苷和齊墩果酸含量，但其采用的是柱切換技術(shù)，方法比較繁瑣，流動相比較復(fù)雜，測定結(jié)果的變異系數(shù)較大。筆者的方法較之更為簡便準(zhǔn)確。當(dāng)歸、川芎和獨(dú)活中均含有揮發(fā)性成分，故本研究采用乙醚萃取制備供試品溶液，參照《中國藥典》對這幾種藥材的薄層色譜鑒別方法進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)果滿意。

在含量測定方法研究過程中，筆者還采用過以下幾種方法：①取本品，加氯仿振搖脫脂，水層水浴揮去溶劑，再以無水乙醇分次溶解，濾過，制備供試液；②取本品，揮去溶劑，殘?jiān)蛹状挤执稳芙?，濾過，制備供試液；③取本品，揮去溶劑，加入硅藻土，攪拌均勻，揮干溶劑，再加入無水乙醇，水浴回流提取，制備供試液；④取本品，加乙酸乙酯振搖提取，水浴揮去溶劑，殘?jiān)执渭?0%甲醇使溶解，制備供試液。結(jié)果表明，采用前兩種方法時，由于本品中含有大量蔗糖，易粘在瓶壁上，影響溶液的轉(zhuǎn)溶；蔗糖沉淀中亦裹挾了較多的成分，影響分析結(jié)果。方法③采用硅藻土為吸附劑，目的是為了除去樣品中的糖等雜質(zhì)成分，但高效液相色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法亦造成橙皮苷成分損失。方法④采用乙酸乙酯溶劑萃取樣品中的橙皮苷成分，但色譜結(jié)果表明，本法提取率較低。故上述方法均不宜采用。本文所采用的供試液制備方法簡便易行，準(zhǔn)確可靠。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑:第一冊[M].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會，1989.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3]劉杰，任孝德，屠萬倩.健兒消食口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)[J].中醫(yī)研究，1997年，19(4): 8-9.

[4]楊江豐，沈利君.HPLC法測定五加皮酒中橙皮苷及齊墩果酸的含量[J].中成藥，1997，19(4): 8-9.