范曉光，賈子樊，李國(guó)梁，韓洪軍，高立棟，張順棠，李燕軍，陳寧*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司, 博士后科研工作站，河南 項(xiàng)城，466200)

尿苷酸是一種重要的核苷酸產(chǎn)品，可作為食品添加劑、藥品以及藥物前體應(yīng)用于不同領(lǐng)域[1]。作為母乳中含量第二大的核苷酸，它是嬰幼兒食品中常用的添加劑[2-3]；能參與肝臟解毒物質(zhì)葡萄糖醛酸苷的合成[4]，也可作為膜磷脂的前體提高腦部胞苷二磷酸膽堿和乙酰膽堿水平[5-6]；以其為前體的碘苷也已廣泛應(yīng)用于臨床[7]。

現(xiàn)有的尿苷酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)降解法?；瘜W(xué)法是將尿苷溶解于酸性溶液中，將2,3位的羥基保護(hù)后再使用有毒的POCl3試劑作為磷酸化試劑合成尿苷酸[8-9]，整個(gè)過(guò)程收率較高但是生產(chǎn)安全性差，容易造成污染。RNA降解法是使用5′-磷酸二酯酶降解來(lái)自于酵母細(xì)胞的RNA[10-11]，整個(gè)過(guò)程相對(duì)環(huán)保但是產(chǎn)品分離困難，細(xì)胞裂解物難于處理。

鑒于現(xiàn)有尿苷酸生產(chǎn)方法的不足，使用生物法制備尿苷酸已經(jīng)成為目前研究的關(guān)注點(diǎn)。WANG等使用產(chǎn)氨短桿菌(CorynebacteriumammoniagenesATCC6872)以乳清酸為底物通過(guò)兩步法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)尿苷酸[12]。YANG等使用重組釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaepYX212-URA5/BJX12)全細(xì)胞催化乳清酸生產(chǎn)尿苷酸[13]。但上述方法均存在生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，生產(chǎn)工藝繁瑣等問(wèn)題。QIAN等使用來(lái)自大腸桿菌(EscherichiacoliK12)的尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase, UCK)以尿苷為底物生成尿苷酸。該方法轉(zhuǎn)化周期較短，尿苷酸收率較高，但是催化過(guò)程中需要以鳥(niǎo)苷三磷酸(Guanosine 5′-triphosphate, GTP)作為磷酸供體，生產(chǎn)成本較高[14]。

為了獲得適用于工業(yè)化生產(chǎn)的尿苷酸制備方法，本研究嘗試使用大腸桿菌(EscherichiacoliBL21(DE3))分別克隆表達(dá)來(lái)源于嗜熱棲熱菌(ThermusthermophilusHB8)[15]以及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168)的尿苷-胞苷激酶。對(duì)獲得的重組尿苷-胞苷激酶的磷酸供體偏好性以及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察。最后對(duì)酶催化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高尿苷酸的產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)以及質(zhì)粒pET-His(Ampr)均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏10 g/L，瓊脂25 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L， VH 1 mg/L，pH 6.5～7.2，葡萄糖115 ℃滅菌15 min，其他成分121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物回收及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因有限責(zé)任公司；尿苷標(biāo)品、尿苷酸標(biāo)品、腺苷三磷酸二鈉、鳥(niǎo)苷三磷酸二鈉購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 質(zhì)粒pETHis-ttCK和pETHis-uck的構(gòu)建

根據(jù)Genbank上T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶UCK同系物ttCK序列編碼基因序列，在其氨基酸序列第93上設(shè)計(jì)點(diǎn)突變，使酪氨酸殘基突變?yōu)榻M氨酸殘基，并用大腸桿菌中常見(jiàn)的密碼子優(yōu)化手段對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其可在大腸桿菌中高效表達(dá)，將優(yōu)化后的序列送至金唯智公司進(jìn)行合成，得到帶有尿苷-胞苷激酶ttCK編碼基因的重組質(zhì)粒pUC57-ttCKY93H。

根據(jù)Genbank上B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶序列編碼基因，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)BamHⅠ 和EcoRⅠ的引物。以B.subtilis168基因組為模板，利用引物(上游引物：5′CGCGGATCCATGGGTAAGAATCCAGTAGTCATTG3′和下游引物5′CCGGAATTC TGCTATGGTATTACAAAATCGCG3′)及Ex-TaqPCR試劑盒擴(kuò)增得到尿苷-胞苷激酶編碼基因uck。

PCR條件為95 ℃ 5 min 一個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min 一個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為50 μL，PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收。

目的產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHⅠ 和EcoRⅠ 酶切、電泳及切膠回收后連接至經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體pET-His，并化轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。Super optimal broth with catabolite repression(SOC)中活化后涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單菌落利用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性菌株接入含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得正確的重組質(zhì)粒。

1.3 E.coliBL21-ttCKY93H和E.coliBL21-uck的構(gòu)建

分別取適宜濃度的質(zhì)粒pETHis-ttCKY93H和pETHis-uck化轉(zhuǎn)至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在SOC中活化后涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落利用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性菌株接入含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后保存至甘油管中備用并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得正確的重組菌株。

1.4 重組菌培養(yǎng)

將E.coliBL21-ttCKY93H及E.coliBL21-uck以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種至5 mL含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基搖管中，37 ℃，200 r/min活化培養(yǎng)12 h，以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種至30 mL含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，再按1%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接至100 mL含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時(shí)，添加終濃度為0.1 mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，37 ℃條件下，200 r/min搖床誘導(dǎo)10 h。

1.5 重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)

將E.coliBL21-ttCKY93H接種至斜面培養(yǎng)基，37 ℃活化培養(yǎng)12 h，再將斜面中的菌全部接種至含有斜面培養(yǎng)基的茄形瓶中，在37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)12 h，再將茄形瓶中的菌全部接種至含有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵條件為37 ℃，pH 7.0，溶氧25%～35%(溶氧0%定義為添加了少量硫酸銅的飽和亞硫酸鈉溶液中的溶氧，溶氧100%定義為靜止空氣中的溶氧)，進(jìn)行重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后流加6 g/L乳糖，并將溫度調(diào)低至32 ℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)至12 h。

1.6 粗酶液制備

用離心管收集培養(yǎng)后的菌液，4 ℃，5 000 r/min，離心10 min，棄掉上清液，收集菌體細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀于5 mL PBS緩沖液(10 mmol/L，pH 8.3)中，利用移液槍反復(fù)吹吸，使菌體細(xì)胞重新懸浮。-80 ℃凍融進(jìn)行細(xì)胞破碎，待溶化后進(jìn)行高速離心1 h去除不溶性碎屑，取得上清液，此時(shí)得到的上清液即為粗酶液，用來(lái)作為研究催化反應(yīng)的酶源。

1.7 酶催化反應(yīng)體系建立

(1)反應(yīng)體系配制：10 mmol/L尿苷，10 mmol/L Mg2+，10 mmol/L GTP或者ATP，不同pH值的PBS緩沖液，適量粗酶液。

(2)酶活力單位定義：在標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定條件下，1 min催化底物尿苷生成1 μmol/L尿苷酸所需的粗酶液量定義為一個(gè)酶活力單位，即1 U。

(3) 5 L罐反應(yīng)體系： 10 mmol/L尿苷，10 mmol/L Mg2+，pH 7.5的PBS緩沖液，適量粗酶液，反應(yīng)過(guò)程中連續(xù)流加1 mmol/L ATP(ATP終濃度10 mmol/L)。

1.8 底物及產(chǎn)物分析方法

對(duì)于底物尿苷和產(chǎn)物尿苷酸，使用高效液相色譜(Agilent 1200)進(jìn)行分析。檢測(cè)條件：紫外檢測(cè)器(270 nm)，色譜柱為Hypersil SAX(5 m，4.6 mm×250 mm)，洗脫液流動(dòng)相為50 mmol/L NH4H2PO3(pH 4.5)，流速為1 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pETHis-ttCKY93H和pETHis-uck的構(gòu)建

首先根據(jù)Genbank上T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶編碼基因序列，利用大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，合成得到目的基因ttCK。根據(jù)TOMOIKE等人的報(bào)道[15]，將T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶氨基酸序列中93位的酪氨酸殘基突變?yōu)榻M氨酸殘基，可以顯著增加該酶對(duì)于尿苷的親和力。因此在合成設(shè)計(jì)時(shí)引入Y93H突變位點(diǎn)。其次根據(jù)B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶編碼基因序列，設(shè)計(jì)引物從B.subtilis168基因組上擴(kuò)增得到目的基因uck。將上述目的基因分別連接到pET-His表達(dá)載體上，利用BamHⅠ 和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)BamHⅠ 和EcoRⅠ雙酶切可以獲得分子量約為2 900 bp及600 bp的片段，與pET-His和目的基因片段的分子量一致，證明上述目的基因已成功連接到表達(dá)載體上。

M-1 kb DNA marker; 1-ttCK片段; 2-pET-His片段;3-重組質(zhì)粒單酶切(BamH I);4-重組質(zhì)粒雙酶切(BamH I/EcoRI)圖1 單雙酶切驗(yàn)證pETHis-ttCKY93H(a)和pETHis-uck(b)Fig.1 Identification of recombinant plasmids of pETHis-ttCKY93H (a) and pETHis-uck digestion by restricted endonuclease (b)

2.2 不同來(lái)源的重組尿苷-胞苷激酶的表達(dá)與鑒定

將重組菌株E.coliBL21-ttCKY93H及E.coliBL21-uck分別接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白后，離心收集菌體，超聲破壁后得到粗酶液。對(duì)破壁之后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，結(jié)果如圖2所示。重組菌株E.coliBL21-ttCKY93H(泳道3)和E.coliBL21-uck(泳道6)超聲破壁后上清液中均在23 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與目的蛋白的分子量一致，說(shuō)明兩種不同來(lái)源的重組尿苷-胞苷激酶均實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。由圖2還可以看出，2株重組菌株超聲破壁后沉淀中也出現(xiàn)目的蛋白條帶(泳道2和5)，說(shuō)明有一些重組酶以包涵體的形式表達(dá)。

M-蛋白marker; 1-3代表E.coli BL21-ttCKY93H;4-5代表E.coli BL21-uck;3,6代表菌體超聲破壁后上清液;2,5代表菌體超聲破壁后沉淀圖2 重組大腸桿菌目的蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins in E.coli BL21

2.3 不同來(lái)源的重組尿苷-胞苷激酶催化特性研究

尿苷-胞苷激酶催化的尿苷向尿苷酸轉(zhuǎn)化過(guò)程需要NTP作為磷酸供體。然而，研究表明很多尿苷-胞苷激酶在胞外催化實(shí)驗(yàn)時(shí)均需要以GTP作為磷酸供體，例如來(lái)自于大腸桿菌、保加利亞乳桿菌的尿苷-胞苷激酶[14]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中分別選擇了GTP以及ATP作為磷酸供體，考察不同來(lái)源的重組尿苷-胞苷激酶的催化能力，結(jié)果如圖3所示。來(lái)源于T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶能以GTP或者ATP作為磷酸供體催化尿苷生成尿苷酸，以GTP為磷酸供體時(shí)的尿苷酸最高得率為93.6%，以ATP為磷酸供體時(shí)的尿苷酸最高得率為87.8%。相比之下，來(lái)源于B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作為磷酸供體時(shí)的催化效果較好，尿苷酸最高得率達(dá)到91.5%。與GTP相比，ATP是更為廉價(jià)的磷酸供體，而且其可以通過(guò)多聚磷酸化酶、乙酸激酶等催化的反應(yīng)進(jìn)行循環(huán)再生[16]。因此，以ATP作為磷酸供體的尿苷-胞苷激酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于降低酶法合成尿苷酸的生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模應(yīng)用具有重要的意義。

a-來(lái)源于嗜熱棲熱菌的尿苷-胞苷激酶；b-來(lái)源于枯草芽孢桿菌的尿苷-胞苷激酶圖3 磷酸供體對(duì)于不同重組尿苷-胞苷激酶的催化效果影響Fig.3 Effect of phosphate donor on the catalyzation of different recombinant uridine/cytidine kinase

2.4 來(lái)源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶的催化反應(yīng)條件優(yōu)化

將來(lái)源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶粗酶液加入到含有10 mmol/L尿苷，10 mmol/L ATP的不同pH值的PBS緩沖液中，對(duì)反應(yīng)溫度以及反應(yīng)pH值進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，反應(yīng)時(shí)間為6 h。由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)靥岣邷囟群蚿H值有利于重組尿苷-胞苷激酶活力的提升，而過(guò)高的溫度以及堿性條件則容易導(dǎo)致酶活力的降低。當(dāng)溫度為37 ℃，pH 7.5時(shí)，重組尿苷-胞苷激酶的活性達(dá)到最高值。

a-溫度優(yōu)化；b-pH優(yōu)化圖4 來(lái)源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶的催化反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of the catalytic reaction conditions of recombinant uridine/cytidine kinase derived from T.thermophilus HB8

在優(yōu)化的催化反應(yīng)條件下，進(jìn)一步考察不同底物濃度對(duì)來(lái)源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶的催化效果影響，結(jié)果如表1所示。由于使用的是粗酶液，因此一部分的尿苷會(huì)在尿苷磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，使得尿苷酸的產(chǎn)量降低。過(guò)量的底物尿苷存在不利于尿苷酸的合成，當(dāng)使用2.5 U粗酶液時(shí)，6 h內(nèi)最多可以催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。如果ATP不足量，則尿苷的產(chǎn)量會(huì)隨之下降。

2.5 利用來(lái)源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶催化尿苷生產(chǎn)尿苷酸

使用2.4中優(yōu)化的反應(yīng)條件，在5 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行重組菌的培養(yǎng)以及酶催化反應(yīng)放大實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。重組菌首先利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)，當(dāng)葡萄糖消耗完全之后(4 h)，連續(xù)流加低濃度乳糖低溫誘導(dǎo)產(chǎn)酶直至菌體生物量不再發(fā)生變化，此時(shí)重組尿苷-胞苷激酶的總酶活可以達(dá)到最大值。

表1 不同底物濃度對(duì)來(lái)源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶的催化效果

a-重組大腸桿菌在5 L罐中的擴(kuò)大培養(yǎng)；b-5 L罐中的酶催化反應(yīng)圖5 利用來(lái)源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶催化尿苷生產(chǎn)尿苷酸Fig.5 Production of UMP from uridine by recombinant uridine/cytidine kinase derived from T.thermophilus HB8

收集重組菌提取尿苷-胞苷激酶進(jìn)行酶催化反應(yīng)放大實(shí)驗(yàn)。在反應(yīng)初始0 h和2 h分別一次性加入1 mmol/L的ATP，觀察尿苷酸的生成情況。結(jié)果表明，當(dāng)加入的ATP消耗完全時(shí)，尿苷酸的合成隨之停止。在反應(yīng)的3～11 h內(nèi)持續(xù)流加1 mmol/L的ATP，尿苷酸也隨之持續(xù)產(chǎn)生，12 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大值8.13 g/L。上述結(jié)果表明，連續(xù)流加低濃度ATP并不會(huì)影響重組尿苷-胞苷激酶的催化效果，后續(xù)可以使用聚磷酸激酶催化的ATP再生反應(yīng)，以少量的ADP作為底物用于尿苷酸的合成，從而進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，增加工業(yè)應(yīng)用可行性。

3 結(jié)論

尿苷酸作為一種重要的食品添加劑和藥物前體，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。然而，現(xiàn)有的尿苷酸生產(chǎn)方法如化學(xué)合成法和核酸水解法存在工藝復(fù)雜、酸堿廢水排放量較大等問(wèn)題。開(kāi)發(fā)高效、環(huán)保的尿苷酸生產(chǎn)制備工藝迫在眉睫。本研究以常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分別過(guò)表達(dá)來(lái)自于嗜熱棲熱菌以及枯草芽孢桿菌的尿苷-胞苷激酶基因，并對(duì)重組酶的催化特征進(jìn)行了分析比較，得到了能夠以ATP作為磷酸供體的尿苷-胞苷激酶，并對(duì)其催化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在37 ℃，pH 7.5的反應(yīng)條件下，使用來(lái)源于嗜熱棲熱菌的尿苷-胞苷激酶，6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。為了進(jìn)一步提升酶促反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)性，今后可以利用大腸桿菌自身的聚磷酸激酶PPK，以多聚磷酸和少量的ADP為底物，實(shí)現(xiàn)ATP的循環(huán)再生。將聚磷酸激酶PPK與尿苷-胞苷激酶ttCK進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，通過(guò)全細(xì)胞的催化方式制備尿苷酸，最終實(shí)現(xiàn)尿苷酸的工業(yè)化生物合成。

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