王木川，楊玉璽，于奕東，玉柱*(.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 00093；.鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 07000)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種多年生的優(yōu)良豆科牧草，有“牧草之王”的美稱，是國(guó)內(nèi)外主要栽培的牧草之一[1-8]。調(diào)制苜蓿干草需要采用田間自然干燥的方式，由于耗時(shí)較長(zhǎng)，受環(huán)境氣候影響較大，會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，有試驗(yàn)表明[1]，干草調(diào)制過(guò)程中都存在雨淋和落葉等損失，損失率高達(dá)30%。在北方地區(qū)，刈割二和三茬苜蓿正值雨季，由于降雨而延遲收割，曬制干草遭雨淋造成的損失更高。因此，為了解決上述問(wèn)題，經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)者多年的研究表明，調(diào)制青貯是解決以上問(wèn)題的理想措施。

與調(diào)制干草相比，制作青貯可減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，而且受天氣影響小。青貯后的苜蓿適口性好，消化率高，對(duì)牲畜的生長(zhǎng)發(fā)育有良好的促進(jìn)作用[2]。由于苜蓿緩沖能值高，可溶性碳水化合物含量低的特性，較難青貯[5]，近年來(lái)隨著青貯技術(shù)的不斷進(jìn)步，可以通過(guò)向青貯中加入添加劑來(lái)改善青貯品質(zhì)[3]。添加蔗糖可以直接為乳酸菌發(fā)酵提供充足的底物[2]。添加乳酸菌制劑能直接提高乳酸菌數(shù)量，乳酸菌的數(shù)量可以保證發(fā)酵初期良好發(fā)酵[4]。纖維素酶能夠?qū)⒅参锛?xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性多糖降解為單糖，進(jìn)而為乳酸菌發(fā)酵增加底物含量[5]。青貯品質(zhì)除了受添加劑的影響外，青貯密度的高低也對(duì)青貯發(fā)酵有重要的影響[6]，合理青貯密度會(huì)促進(jìn)窖內(nèi)空氣的排出，營(yíng)造一個(gè)良好的厭氧環(huán)境，對(duì)青貯發(fā)酵具有積極的影響。因此，本試驗(yàn)選擇添加劑和不同青貯密度兩個(gè)因素，旨在研究?jī)梢蛩丶捌浠プ餍?yīng)對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)的影響，為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與添加劑

本試驗(yàn)以2015年內(nèi)蒙古鄂爾多斯騎士乳業(yè)苜蓿種植基地(內(nèi)蒙古自治區(qū)達(dá)拉特旗)種植的第二茬紫花苜蓿為原料，在初花期刈割后進(jìn)行晾曬至含水量約60%。其特性見表1。乳酸菌制劑(Lactobacillus.plantarum, LP和Lactobacillus.casei, LC)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)青貯試驗(yàn)室研發(fā)；蔗糖:購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；纖維素酶(acremonium cellulose, CE)：固態(tài)酶，多組分的復(fù)合生物催化劑，標(biāo)準(zhǔn)活力單位(CMC酶)1.06×103U·g-1，由日本雪印公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用2×9雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，兩個(gè)密度處理，即600和650 kg·m-3，8種添加劑(S、LP、LC、CE、LP+S、LC+S、LP+CE和LC+CE)和1個(gè)空白處理(CK)。將刈割后的紫花苜蓿晾曬至含水量為60%左右，切碎至1～2 cm，將切短的青貯原料與添加劑充分混合均勻后，按不同密度稱取原料，分別按兩個(gè)密度稱取300和325 g裝入500 mL的聚乙烯青貯罐中。 共18個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，見表2。發(fā)酵45 d后開罐，分析其發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

發(fā)酵45 d后打開青貯罐，除去表層發(fā)霉青貯飼料，將剩余青貯飼料取出充分混勻，稱取20 g青貯飼料，加入180 mL蒸餾水， 攪拌均勻， 用榨汁機(jī)絞碎1 min，先后用4層紗布和定性濾紙過(guò)濾，將濾液置于-20 ℃冰箱中保存，用于pH值、有機(jī)酸(乳酸、乙酸、丙酸和丁酸)及氨態(tài)氮的測(cè)定；從剩余青貯飼料中稱取150 g左右的青貯飼料，放于65 ℃烘箱烘48 h至恒重，將烘干的樣品粉碎，過(guò)1 mm篩，置于自封袋中保存，用于測(cè)定干物質(zhì)(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)。

表1 苜蓿原料特性Table 1 Pre-ensiled characteristics of the alfalfa (%)

表2 苜蓿青貯試驗(yàn)處理Table 2 The treatment of alfalfa silage

注：CK為對(duì)照；S為蔗糖；CE為纖維素酶；LP：植物乳桿菌；LC：乳酪乳桿菌為乳酸菌劑，兩種菌劑均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)青貯試驗(yàn)室研發(fā)。CFU·g-1表示1 g鮮草添加的活菌數(shù)。

Note: CK: Control group; S: Sucrose; CE: Cellulose enzyme; LP:Lactobacillus.plantarum; LC:Lactobacillus.casei. CFU·g-1: Colony-forming units per gram fresh herbage.

pH值用雷磁PHS-3C型pH計(jì)測(cè)定；使用SHIMADZE-10A型高效液相色譜分析乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量；色譜柱：Shodex Rspak Kc-811s-DVB gel Column 30 mm×8 mm，檢測(cè)器：SPD-M10AVP，流動(dòng)相：3 mmol·L-1高氯酸，流速：1 mL·min-1，柱溫50 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量5 μL[7]；采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)氨態(tài)氮占總氮含量[8]。樣品干物質(zhì)(DM)采用烘箱烘干法測(cè)定；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)采用Van Soest方法測(cè)定[9]；用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白(CP)的含量[10]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 21.0中的比較均值進(jìn)行雙因素方差分析，用Duncan進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷。

表3 苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)Table 3 The fermentation quality of alfalfa silage

注：同一列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。ND：未檢測(cè)到；NS：差異不顯著；***：P<0.001；**：P<0.01；*：P<0.05。下同。

Note: Different letters in the same line mean significant difference at 0.05 level. ND: Not detection; NS: Not significant. ***：P<0.001；**：P<0.01；*：P<0.05. The same below.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同青貯密度和添加劑對(duì)紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

各處理的發(fā)酵品質(zhì)分析結(jié)果見表3，在相同青貯密度條件下，與對(duì)照組相比，各處理組的pH值均降低, 其中處理組S、LP+S和LC+S的pH值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，復(fù)合添加LP+S和LC+S的pH值顯著低于LP和LC組(P<0.05)，處理組LP+CE和LC+CE的pH值與處理組LP和LC相比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。處理組LP+S和LC+S的乳酸含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他處理組與對(duì)照組的乳酸含量差異不顯著(P>0.05)。不同處理組乙酸含量與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)。各個(gè)處理組間的丙酸含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。丁酸只有在對(duì)照組檢測(cè)出。處理組的氨態(tài)氮占總氮的比(以下簡(jiǎn)稱氨態(tài)氮)均低于對(duì)照組，其中S、LP+S和LC+S這3個(gè)處理組的氨態(tài)氮含量與對(duì)照組相比，差異最為顯著(P<0.05)。本試驗(yàn)的兩種青貯密度對(duì)pH值和有機(jī)酸含量無(wú)顯著影響(P>0.05)，對(duì)氨態(tài)氮含量有顯著影響(P<0.05)。不同密度和添加劑對(duì)紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)無(wú)交互作用。

2.2 不同青貯密度和添加劑對(duì)紫花苜蓿青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

表4列出了各處理營(yíng)養(yǎng)成分分析結(jié)果，在相同青貯密度條件下，與對(duì)照組相比，處理組S、LP+S和LC+S的干物質(zhì)含量顯著上升(P<0.05)， 其他處理組的干物質(zhì)含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。 與對(duì)照組相比，處理組的粗蛋白含量都高于對(duì)照組，其中添加LP和LC的粗蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比較，各處理組中性洗滌纖維的含量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，處理組S、LP+S和LC+S酸性洗滌纖維含量與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。在相同處理?xiàng)l件下，不同青貯密度條件下的干物質(zhì)含量的影響有顯著差異(P<0.05)，粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量的無(wú)顯著差異(P>0.05)。添加劑對(duì)青貯后的干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量都有顯著影響(P<0.05)。密度和添加劑的交互作用對(duì)青貯后的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)無(wú)顯著性影響(P>0.05)。

表4 苜蓿青貯的營(yíng)養(yǎng)成分Table 4 The chemical components of alfalfa silage treated

3 討論

苜蓿由于碳水化合物含量少，緩沖能值高，屬于不易青貯的牧草作物[11]。在實(shí)踐生產(chǎn)中，需要適量的加入不同的添加劑來(lái)改善青貯效果。青貯飼料中可溶性糖分的含量是青貯飼料制作的關(guān)鍵。糖類是乳酸菌發(fā)酵的底物，一般要求其含量在2%以上，以提供乳酸菌生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)[12]。蔗糖為青貯發(fā)酵促進(jìn)劑，它通過(guò)增強(qiáng)乳酸菌的活動(dòng)，產(chǎn)生更多的乳酸，使青貯飼料的pH值迅速下降，達(dá)到成功青貯的目的[13]。朱慧森等[14]將1%，2%和3%這3個(gè)濃度的蔗糖添加到紫花苜蓿中，3個(gè)處理組的氨態(tài)氮含量較對(duì)照組顯著降低，青貯品質(zhì)最好。本試驗(yàn)中蔗糖的添加量為2%，達(dá)到乳酸菌發(fā)酵的底物要求，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，使pH值和氨態(tài)氮顯著低于對(duì)照組，抑制了蛋白質(zhì)的分解。有機(jī)酸含量可以反映青貯飼料的質(zhì)量，青貯飼料中豐富的乳酸含量可以降低pH值，提供酸性環(huán)境，從而抑制有害微生物的繁殖[15]。本試驗(yàn)蔗糖處理組的乳酸含量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明蔗糖可以為乳酸菌提供更多底物，從而促進(jìn)發(fā)酵，產(chǎn)生更多的乳酸，于國(guó)輝等[16]的試驗(yàn)也得出類似結(jié)果。

青貯中添加乳酸菌很有必要，很多研究[17-19]表明，添加乳酸菌制劑可以保證青貯發(fā)酵初期所需的乳酸菌數(shù)量，使之盡早的進(jìn)入發(fā)酵階段，使pH值迅速下降，抑制微生物對(duì)蛋白質(zhì)的水解作用，減少青貯飼料中氨態(tài)氮的生成。本試驗(yàn)中，添加LP和LC使青貯pH值和氨態(tài)氮含量下降，乳酸含量升高，CP含量顯著高于對(duì)照組，表明在苜蓿青貯中添加乳酸菌可以提高青貯品質(zhì)。Fllya等[20]研究表明，乳酸菌制劑對(duì)苜蓿青貯有促進(jìn)的效果，可以改善發(fā)酵品質(zhì)。

在苜蓿青貯中混合添加蔗糖和乳酸菌后，直接增加發(fā)酵初期的乳酸菌數(shù)量和底物的含量，促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程，產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低pH值，達(dá)到一個(gè)良好的發(fā)酵環(huán)境，從而有效的保障青貯飼料的品質(zhì)。本試驗(yàn)LP+S和LC+S這兩個(gè)處理組的乳酸含量顯著升高，pH值和氨態(tài)氮含量顯著降低，粗蛋白含量高于對(duì)照組，說(shuō)明乳酸菌和蔗糖混合處理可以改善青貯飼料的品質(zhì)，張麗英[9]也得出類似結(jié)果。

研究表明[21]，纖維素酶可以降解植物細(xì)胞壁，將植物性多糖降解為單糖，為乳酸菌發(fā)酵提供底物，促進(jìn)青貯的發(fā)酵，從而改善青貯品質(zhì)。添加纖維素酶后，氨態(tài)氮含量顯著降低，與Hristov[22]的試驗(yàn)結(jié)果相同?；旌咸砑尤樗峋屠w維素酶后進(jìn)行青貯，與對(duì)照組在粗蛋白、氨態(tài)氮含量、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維上差異并不顯著，可能是因?yàn)楦晌镔|(zhì)含量(41.03%)比較高，屬于半干青貯，混合添加乳酸菌和纖維素酶對(duì)苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分影響不大。有研究表明[23]，苜蓿青貯水分含量過(guò)低，多數(shù)細(xì)菌處于生理干旱狀態(tài)，因此添加劑沒(méi)能夠有效地發(fā)揮作用，但苜蓿青貯仍可以保存完好。

青貯密度也是苜蓿青貯成敗的至關(guān)重要的因素，高密度青貯能有效的營(yíng)造一個(gè)厭氧的環(huán)境，利于乳酸菌發(fā)酵。研究表明[6]，青貯窖內(nèi)的空氣存量會(huì)影響好氧微生物的活動(dòng)和呼吸作用，進(jìn)而導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和乳酸發(fā)酵底物損失，因此，排除空氣是青貯制作的前體。本試驗(yàn)中設(shè)置兩個(gè)青貯密度600和650 kg·m-3，隨著密度升高，青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)成分變化不大，而對(duì)氨態(tài)氮含量有顯著影響，這與Shao等[6]的試驗(yàn)結(jié)果一致。說(shuō)明隨著青貯密度的升高，能夠抑制青貯飼料中蛋白質(zhì)的降解。

本研究中，密度和添加劑之間的互作作用對(duì)苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分均無(wú)顯著影響。由于本試驗(yàn)原料水分含量較低，屬于半干青貯，在進(jìn)行青貯裝罐時(shí)很難做到更大密度的處理，所以隨著青貯密度的升高，苜蓿青貯品質(zhì)沒(méi)有得到明顯的改善。

4 結(jié)論

添加蔗糖可以顯著的改善苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分；添加乳酸菌對(duì)于苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分有一定的改善，但效果不如添加蔗糖和乳酸菌混合處理的效果好；添加纖維素酶和混合添加乳酸菌和纖維素酶對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)沒(méi)有明顯的改善效果，可能是原料含水量較低，抑制了生物添加劑的活性；本試驗(yàn)隨著青貯密度的提升，沒(méi)有明顯改善苜蓿青貯品質(zhì)。

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