白子上 曹湜歐 吳重璽 范家齊 和 淵

（中國人民大學(xué)附屬中學(xué) 北京 100080）

1 研究背景

隨著基因工程技術(shù)日趨成熟，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建生物工程菌發(fā)酵工藝獲得產(chǎn)品是當(dāng)前的發(fā)展趨勢，其目的是為了獲得大量的外源基因產(chǎn)物。外源基因的高水平表達(dá)受到其所處的環(huán)境條件影響，本實(shí)驗(yàn)主要研究了誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG 濃度對于蛋白表達(dá)的影響。

誘導(dǎo)開始時(shí)間的選擇和誘導(dǎo)時(shí)長對于目的蛋白的表達(dá)水平有重要影響。在大腸桿菌在菌體生長的對數(shù)早期進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體量較少，表達(dá)量有限。在對數(shù)晚期進(jìn)行誘導(dǎo)，由于營養(yǎng)的消耗及代謝物的積累，菌體生長受到抑制，表達(dá)量也有所下降。因此，通常選擇大腸桿菌細(xì)胞量OD600為0.6～0.8 左右時(shí)開始誘導(dǎo)，細(xì)菌處于比較理想的狀態(tài)［1］，此后加入誘導(dǎo)劑后的表達(dá)時(shí)間需要進(jìn)行摸索才能使表達(dá)量優(yōu)化到最佳的水平。

誘導(dǎo)劑的濃度對大腸桿菌蛋白的表達(dá)也可能存在影響。操縱子是基因表達(dá)和調(diào)控的單元，主要見于原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［2］。用乳糖或者其類似物（例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG）可以體外啟動基因的表達(dá)，因此作為一種誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑被實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。

溫度是影響工程菌生長、 質(zhì)粒穩(wěn)定性和重組產(chǎn)物形成的重要因素。大腸桿菌的最適生長溫度為37℃左右，然而在較高溫度下，細(xì)菌的生長速率較高導(dǎo)致發(fā)酵過程中易積累大量代謝副產(chǎn)物，從而對菌體生長和目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)生抑制［2］。

本實(shí)驗(yàn)通過對不同誘導(dǎo)劑濃度下重組大腸桿菌蛋白PYL10 的表達(dá)，探索誘導(dǎo)劑濃度對蛋白表達(dá)的影響。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3），PYL10 表達(dá)質(zhì)粒，LB 液體培養(yǎng)基，LB平板，氨芐青霉素，IPTG，考馬斯亮藍(lán)R-250；蛋白電泳液，脫色液，超凈工作臺，酒精燈，涂布器，微量移液器，錐形瓶，鋁箔紙，一次性手套，渦旋混合器，離心機(jī)，紫外可見光分光光度計(jì)，超聲破碎儀，天平，計(jì)時(shí)器，臺式恒溫振蕩器，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，鎳-純化層析柱，蛋白質(zhì)電泳儀。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 目的基因的轉(zhuǎn)化 取100 μL 冰上融化的BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞于潔凈的1.5 mL 離心管中，加入PYL10 表達(dá)質(zhì)粒2 μL，用微量移液器輕輕吹吸至完全混勻，冰浴25 min。42℃水浴熱激90 s 后，迅速放回冰上靜置2 min，此步驟應(yīng)減少晃動，以免轉(zhuǎn)化效率降低。在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行操作，加入700 μL 未添加抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，用加樣槍輕輕吹吸至混勻，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以37℃，200 r/min，復(fù)蘇60 min。用離心機(jī)以5 000 r/min 離心1 min，留取100 μL 左右上清，用移液槍輕輕吹打重懸細(xì)胞。用移液槍在含有100 μg/mL 的LB 固 體 平 板 上 加 入8 μL IPTG 和40 μL X-gal，用涂布器涂布均勻后將菌液涂布到平板上。用封口膜封住平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)［3-4］。

2.2.2 重組菌株蛋白水平的驗(yàn)證 取30 mL 含有氨芐抗生素的LB 液體培養(yǎng)基于50 mL 錐形瓶中，加入1mL 菌液后分別37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h 后加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/L，4 h 后收集菌液，OD600nm比色。用超聲破碎儀將收集的菌體破菌，并用鎳柱純化蛋白后進(jìn)行SDSPAGE 電泳檢測。取陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 不同培養(yǎng)溫度對大腸桿菌表達(dá)蛋白的影響 取30 mL 含有氨芐抗生素的LB 液體培養(yǎng)基于50 mL 錐形瓶中，加入1 mL 菌液后分別置于22℃和37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h 后加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/L，4 h 后收集菌液，OD600nm比色。用超聲破碎儀將收集的菌體破菌，并用鎳柱純化蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測［5］。

2.2.4 不同誘導(dǎo)劑濃度對大腸桿菌表達(dá)蛋白的影響 取30 mL 含有氨芐抗生素的LB 液體培養(yǎng)基于50 mL 錐形瓶中，加入1 mL 菌液后分別置于37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h 后分別加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L，4 h后收集菌液，OD600nm比色，用超聲破碎儀將收集的菌體破菌，并用鎳柱純化蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測［7］。

2.2.5 蛋白純化 當(dāng)E.coli細(xì)胞的濃度達(dá)到OD600為0.8 左右時(shí)，開始誘導(dǎo)，并且記錄開始誘導(dǎo)時(shí)間，然后按時(shí)間點(diǎn)處理樣品：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，將細(xì)菌離心沉淀，用細(xì)胞裂解液（Lysis buffer）重懸沉淀至10 mL，然后超聲破碎1 min，再次離心，將離心后上清上樣到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL的柱洗滌液（20 mmol/L 咪唑+細(xì)胞裂解液）洗滌3次，最后0.5 mL 的柱洗脫液（250 mmol/L 咪唑+細(xì)胞裂解液）洗脫，獲得純化后的目的蛋白樣品［8］。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 誘導(dǎo)時(shí)間的影響 當(dāng)E.coli的細(xì)胞量達(dá)到OD600=0.8 左右時(shí)，開始誘導(dǎo)并記錄誘導(dǎo)時(shí)間，然后按時(shí)間點(diǎn)取樣品1 mL，如表1所示。離心沉淀后，用細(xì)胞裂解液50 μL 重懸，取2 μL 重懸起的樣品并加入18 μL 上樣緩沖液，于95℃水浴煮沸5 min，取其中10 μL 液體進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。結(jié)果如圖1，隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，大腸桿菌細(xì)胞的全蛋白表達(dá)水平隨之提高，各類蛋白濃度均有所增加。這情況同樣存在于純化后PYL10 蛋白的表達(dá)水平，并且在培養(yǎng)16 h 后目的蛋白濃度達(dá)到最高，如圖2所示。

表1 PYL10蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間條件

3.2 誘導(dǎo)溫度 設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度條件探索誘導(dǎo)溫度對于蛋白表達(dá)的影響，如表2所示。當(dāng)E.coli細(xì)胞的濃度達(dá)到約為OD600為0.8 左右時(shí)，開始誘導(dǎo)，并且記錄開始誘導(dǎo)時(shí)間，達(dá)到5 h 時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)菌液樣品，將細(xì)菌離心沉淀，用細(xì)胞裂解液重懸沉淀至10 mL，然后超聲破碎1 min，再次離心，將離心后上清上樣到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL 的柱洗滌液（20 mmol/L 咪唑+細(xì)胞裂解液）洗滌3 次，最后0.5 mL 的柱洗脫液（250 mmol/L咪唑+細(xì)胞裂解液）洗脫，獲得純化后的目的蛋白樣品。結(jié)果如圖3所示，隨著誘導(dǎo)溫度條件的提高，PYL10 蛋白表達(dá)水平隨之提高，在22℃達(dá)到最大，當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，PYL10 蛋白表達(dá)水平相對降低。

表2 PYL10 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)溫度條件

3.3 誘導(dǎo)劑IPTG 濃度

表3 PYL10 蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑不同濃度

按照表3所示，設(shè)置不同的IPTG 誘導(dǎo)濃度條件探索，當(dāng)E.coli 細(xì)胞的濃度達(dá)到OD600約為0.8左右時(shí)，開始誘導(dǎo)，并且記錄開始誘導(dǎo)時(shí)間。當(dāng)達(dá)到12 h，取細(xì)胞培養(yǎng)菌液樣品，將細(xì)菌離心沉淀，用細(xì)胞裂解液重懸沉淀至10 mL，然后超聲破碎1 min，再次離心，將離心后上清上樣到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL 的柱洗滌液（20 mmol/L 咪唑+細(xì)胞裂解液）洗滌3 次，最后0.5 mL 的柱洗脫液（250 mmol/ L 咪唑+細(xì)胞裂解液）洗脫，獲得純化后的目的蛋白樣品。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG 濃度增加到200 μmol/L 時(shí)，PYL10 蛋白表達(dá)量最高。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論和討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在22℃時(shí)加入200 μmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)16 h 最適合PYL10 的蛋白表達(dá)，這一結(jié)果與已發(fā)表論文中提到的結(jié)果是一致的［9］。本文新意在于系統(tǒng)性地探索了每個(gè)變量（表達(dá)溫度、表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度）對于PYL10 蛋白表達(dá)的影響,并且將每個(gè)優(yōu)化后的結(jié)果結(jié)合在一起, 以期找到一個(gè)最優(yōu)化的、使得PYL10 蛋白表達(dá)量最大的條件。

盡管在22℃和37℃時(shí)培養(yǎng)菌液的吸光度值相近，即細(xì)胞密度無明顯差異，但22℃時(shí)大腸桿菌蛋白表達(dá)明顯高于37℃，可能是與在37℃時(shí)蛋白表達(dá)太快、折疊不好有關(guān)［10］。另外，IPTG 作為一種廣泛應(yīng)用的誘導(dǎo)劑，可競爭性地與阻遏蛋白結(jié)合從而啟動目的蛋白的轉(zhuǎn)錄。如果濃度過低則達(dá)不到與阻遏蛋白結(jié)合的飽和濃度從而對目的蛋白的表達(dá)造成影響，如果濃度過高則造成經(jīng)濟(jì)上的不劃算，因此0.2 mmol/L 的IPTG 濃度已經(jīng)足夠誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。