楊宏志，王洪江，張春芝，鐘運(yùn)翠，魏程程

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319）

沙棘中富含100多種活性成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如維生素、黃酮、甾醇、類脂和氨基酸等。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，主要分布在沙棘的果肉、果皮、葉片和種子中[1]。所以以沙棘為主的食品、保健產(chǎn)品的研制與生產(chǎn)目前也呈現(xiàn)出了向好的發(fā)展趨勢(shì)。沙棘加工的常見副產(chǎn)品——沙棘果渣，往往由于缺乏精深加工導(dǎo)致其附加值降低，造成浪費(fèi)。本試驗(yàn)以沙棘果渣為原料，試圖提取果渣中的沙棘多糖，為更好的提取和利用沙棘多糖奠定基礎(chǔ)。利用相似相溶的原理，用熱水法提取得到沙棘果渣多糖可以在保證多糖提取率的同時(shí)更加有效的保留其中的有效活性成分[2]。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

沙棘果渣，含水率為6.44%，購(gòu)于黑龍江大慶市場(chǎng)；葡萄糖，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；濃硫酸，齊齊哈爾市東大化工試劑廠提供；無(wú)水乙醇，沈陽(yáng)市華東試劑廠提供；苯酚，北京市雙翔達(dá)生化試劑儀器有限公司提供；丙三醇，天津市紅巖化學(xué)試劑廠提供；氫氧化鈉，哈爾濱市金麗化工試劑有限公司提供；3，5-二硝基水楊酸，湖州生物化學(xué)廠（上海）提供；蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。所有試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；754紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜有限公司產(chǎn)品；ALC-310.3型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HWS24型電子恒溫水浴箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 沙棘多糖提取技術(shù)路線

將沙棘果渣經(jīng)除雜后粉碎過(guò)40目篩，而后脫脂、脫單糖，過(guò)濾后經(jīng)熱風(fēng)烘干得到沙棘果渣粉末，用熱水法提取制得沙棘粗多糖，最后測(cè)沙棘粗多糖含量。

2.2 多糖含量的測(cè)定

參照苯酚-硫酸法[3]。濃硫酸可使多糖水解生成單糖與此同時(shí)迅速脫水形成糠醛衍生物，在苯酚的作用下生成有色的化合物。此種有色化合物在波長(zhǎng)490 nm處有最大吸收，通過(guò)測(cè)定OD值可測(cè)得其含量。

取烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖0.010 0 g配制成100mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL加蒸餾水至2.0 mL，而后加入1mL 5%的苯酚溶液，滴加濃硫酸5 mL，搖勻并于室溫下放置0.5 h。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線以得出回歸方程。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法，吸取0.2 mL樣液加蒸餾水至2.0 mL，加入1 mL 5%的苯酚溶液，滴加濃硫酸5mL，搖勻并于室溫下放置0.5 h。以加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值，代入回歸方程求得樣液的多糖含量。

2.3 還原糖含量的測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸比色法[4]測(cè)定：將0.65 g的3，5-二硝基水楊酸，溶于5 mL蒸餾水中，置于100mL的容量瓶中，加入65mL 1mol/L的氫氧化鈉溶液，再加入4.5 g甘油，搖勻后定容至100mL。制得3，5-二硝基水楊酸試劑。

比色法標(biāo)曲的繪制：首先稱量100mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，然后添加蒸餾水稀釋，配成1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于試管中，各試管中補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，分別加入1 mL配制的DNS試劑，沸水?。?00℃）加熱5 min，然后取出試管用自來(lái)水冷卻至室溫，再加入8mL蒸餾水，搖勻，測(cè)定吸光度（540 nm）。以葡萄糖的量為X軸，吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

樣品含量的確定：取試樣1mL放入試管中，加入1 mL的3，5-二硝基水楊酸試劑，于熱水浴中反應(yīng)5 min后，迅速冷卻至室溫加入8 mL蒸餾水，搖勻，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定其OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其還原糖的含量。

2.4 多糖提取得率的確定

多糖提取得率的計(jì)算方法參考了熊冰等人[5]的方法。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）多糖含量的測(cè)定。根據(jù)前文所述，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），標(biāo)準(zhǔn)曲線中回歸方程的R2非常接近1，說(shuō)明方程和曲線擬合度高。將樣品于490nm處測(cè)得的OD值代入方程計(jì)算得到沙棘多糖含量 （μg）。

（2）還原糖含量的測(cè)定。將沙棘多糖樣品用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)吸光度，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2） 方程計(jì)算可得到沙棘多糖還原糖得率。將樣品測(cè)得的OD值代入回歸方程計(jì)算沙棘多糖含量（μg）。相關(guān)系數(shù)非常接近1說(shuō)明方程和曲線擬合好。

標(biāo)準(zhǔn)曲線（苯酚-硫酸法） 見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線（DNS法） 見圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線（苯酚-硫酸法）

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線（DNS法）

3.2 單因素試驗(yàn)

固定試驗(yàn)溫度為60℃，提取時(shí)間為40min，取料液比為 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35進(jìn)行熱水法提取多糖單因素試驗(yàn)，而后測(cè)量OD值，計(jì)算得出多糖得率。用蒸餾水作為空白，每組測(cè)3個(gè)平行樣。將計(jì)算所得出的結(jié)果繪制出多糖得率與料液比之間的關(guān)系圖，多糖得率隨料液比的變化。

料液比與多糖提取率的關(guān)系見圖3。

圖3 料液比與多糖提取率的關(guān)系

從圖3可看出，當(dāng)料液比為1∶25時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，當(dāng)料液比低于1∶25時(shí)，隨著料液比的增大，多糖得率增大，當(dāng)料液比從1∶20～1∶25時(shí)，多糖得率出現(xiàn)明顯的“陡坡”式增大；而料液比繼續(xù)增大時(shí)，多糖得率反而隨著溶劑量的增大而減小[6]。出現(xiàn)此種情況極大地原因可能是，隨著溶劑的增加，溶出物中除多糖外還含有其他物質(zhì)，多糖與其相結(jié)合，從而使多糖的提取量下降。

固定料液比為1∶20，提取溫度為60℃，選取提取時(shí)間20，40，60，80，100 min進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定吸光度值，計(jì)算得出多糖得率。用蒸餾水作為空白，每組測(cè)3個(gè)平行樣。根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出多糖得率與提取時(shí)間的關(guān)系圖，分析多糖得率隨提取時(shí)間的變化規(guī)律。

時(shí)間與多糖提取率的關(guān)系見圖4。

圖4 時(shí)間與多糖提取率的關(guān)系

從圖4可看出，當(dāng)提取時(shí)間少于80 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率增大，當(dāng)時(shí)提取時(shí)間從20min延長(zhǎng)至40min時(shí)，多糖得率急劇增加。提取時(shí)間延長(zhǎng)至40 min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)多糖得率雖中間有略微下降但總體呈增加趨勢(shì)。提取時(shí)間達(dá)到80 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值。繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間多糖得率反而下降[7-8]。出現(xiàn)此種情況極有可能是，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致水分蒸發(fā)量過(guò)多，沙棘果渣黏度增大，使得多糖的提取變得困難，從而使多糖的提取量減少[7]。

選取料液比為1∶20，提取時(shí)間為40min，取提取溫度為50，60，70，80，90℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定吸光度值，計(jì)算得出多糖得率。用蒸餾水作為空白，每組測(cè)3個(gè)平行樣。將計(jì)算所得出的結(jié)果繪制出多糖得率與提取溫度之間的關(guān)系圖，多糖得率隨提取溫度的變化。

溫度與多糖提取率的關(guān)系見圖5。

從圖5可看出，多糖提取量隨著提取溫度的增大而增加，提取溫度為90℃時(shí)具有最大的多糖得率。但是考慮到多糖的生物活性與溫度有很大的關(guān)系，溫度過(guò)高會(huì)使得生物活性降低，所以選擇溫度為3個(gè)中間溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.3 因素間互作效應(yīng)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的方法，在選定的3個(gè)因素中固定1個(gè)因素，選取另一因素的2個(gè)條件與其他一因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)并作圖。

圖5 溫度與多糖提取率的關(guān)系

圖6 料液比與溫度的互作效應(yīng)影響

料液比與溫度的互作效應(yīng)影響見圖6，時(shí)間與料液比的互作效應(yīng)影響見圖7，時(shí)間與溫度的互作效應(yīng)影響見圖8。

圖7 時(shí)間與料液比的互作效應(yīng)影響

圖8 時(shí)間與溫度的互作效應(yīng)影響

從圖6，圖7可看出，料液比與溫度之間、料液比與提取時(shí)間之間沒(méi)有交互影響；但從圖8中看出，溫度與提取時(shí)間之間有比較弱的交互影響。

3.4 正交試驗(yàn)

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，L9（34）試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 L9（33）試驗(yàn)方案及結(jié)果

通過(guò)表2可以看出，3個(gè)因素的級(jí)差大小順序?yàn)镽3＞R2＞R1，說(shuō)明上述3個(gè)因素對(duì)多糖得率的貢獻(xiàn)影響從大到小順序?yàn)镃＞B＞A，即按照對(duì)多糖得率的影響來(lái)說(shuō)溫度＞料液比＞提取時(shí)間。因此熱水法提取沙棘多糖最佳工藝條件組合為C3B1A1，即料液比為1∶25（g∶mL），提取溫度為80℃，提取時(shí)間為40 min，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得到在此條件下沙棘果渣多糖提取率達(dá)到102.36mg/g。

4 結(jié)論

依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出，用熱水法提取沙棘果渣中的沙棘多糖的最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶25（g∶mL），溫度80℃，提取時(shí)間40 min。在此工藝條件下沙棘粗多糖提取率可達(dá)102.36 mg/g，其多糖提取率顯著高于微波、超聲等其他提取方法。熱水法提取耗時(shí)長(zhǎng)、耗能高的缺點(diǎn)是今后要進(jìn)一步解決的問(wèn)題。

[1]IV Bartish，N Jeppsson.Inter-and intraspecific genetic varation in hippophae （Elaeagnaceae） investigated by RAPD marders[J].Plant Systematics and Evolution，2000 （5）：85-101.

[2]張黎明，趙朝，高文遠(yuǎn).玉屏風(fēng)總多糖的醇提水提工藝條件優(yōu)化 [J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（10）：2 474-2 478.

[3]張惟杰.復(fù)合多糖生化技術(shù) [M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1987：26-30.

[4]井樂(lè)剛.大豆乳清中大豆異黃酮的提取純化及其生物活性的研究 [D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[5]王秀娟.超聲波輔助醬鹵雞蛋加工工藝研究 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2007（6）：34-35，42.

[6]黃婧，張名位，辛修峰，等.苦瓜粗多糖提取工藝的優(yōu)化 [J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2007，38（6）：112-116.

[7]鄧紅霞.紫菜多糖提取及殘?jiān)醚芯?[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[8]林永賢，于海峰，許鵬，等.發(fā)菜多糖的提取及性質(zhì)研究 [J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（5）：34-36.

[9]楊宏志，鐘運(yùn)翠，閻福林，等.沙棘多糖提取工藝研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，21（2）：68-71.◇