韓春然，張家成，王 鑫，那治國，2，王佳寧，謝靜南，張 凱

（1.哈爾濱商業(yè)大學，高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076；2.黑龍江東方學院，黑龍江哈爾濱 150066）

藍靛果忍冬（Lonicera enulis Turcz） 簡稱藍靛果，屬被子植物門，忍冬科，忍冬屬。藍靛果原產(chǎn)于北半球溫帶地區(qū)，隨后被引入世界各國種植培育，如今在中國、俄羅斯、日本及朝鮮等絕大多數(shù)亞歐地區(qū)都有藍靛果的種植與開發(fā)。我國對藍靛果的研究相對其他發(fā)達國家起步晚。起初，我國主要致力于研究關(guān)于野生藍靛果的資源調(diào)查和人工栽培這2個方面；近年來，隨著對野生藍靛果開發(fā)利用的研究逐漸深入，在生態(tài)學特性、器官解剖、分類、地位等一系列研究上，我國學者取得了較大進展。藍靛果果實不僅富含礦物質(zhì)、各類氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，而且還含有大量的花色苷、黃酮、多酚等對人體有益的活性物質(zhì)[1-5]。這些物質(zhì)都對人體健康具有促進作用，使藍靛果具有較高的藥用功能和保健價值[6-8]。

張雁南等人[9]的研究發(fā)現(xiàn)微波輔助提取法中，體積分數(shù)為65%無水乙醇提取出的藍靛果紅色素可以清除自由基，從而起到抗氧化作用。王恩福等人[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過注射高脂食物使大鼠患有試驗型高血脂，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯所提取的藍靛果提取物可以使大鼠體內(nèi)密度脂蛋白和血清中超氧化物歧化酶的含量增加，而甘油三酯和血清中丙二醛的含量明顯減少，表明該物質(zhì)對高脂大鼠具有一定的降脂功效。劉奕琳等人[11]采用細胞凋亡的試驗研究表明，藍靛果花色苷在一定條件下對人體肺癌細胞、肝癌細胞和宮頸癌細胞均有很強的抑制作用，其安全無毒和極佳的生理功效，已經(jīng)使多糖成為一類具有開發(fā)價值的新型藥物資源[12]。一系列的研究表明，多糖具有提高機體免疫力、預防疲勞、降血糖、降血脂、抗癌、抑菌、防輻射等生理功效[13]?，F(xiàn)階段，大量的動植物多糖已經(jīng)被成功開發(fā)利用，如大棗、南瓜多糖[14-15]、殼聚糖等。藍靛果中含有較為豐富的多糖，是一種良好的提取原料。目前，對藍靛果的研究集中在花色苷的提取、純化及功能性研究，對藍靛果多糖的研究還是空白。所以，優(yōu)化藍靛果多糖的提取工藝，對深入研究其功能性及系列產(chǎn)品的開發(fā)利用具有重要意義。

1 試驗部分

1.1 原料與試劑

藍靛果，黑龍江勃利縣采摘；硫酸、苯酚、乙醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司提供；快流速DEAE-瓊脂糖凝膠，北京博奧拓達科技有限公司提供。

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；UV-9100型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品；HL-2B型數(shù)顯恒流泵，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標準品250 mg置于250 mL的容量瓶中，加水適量使其溶解、定容。精密吸取上述溶液25 mL，定容至250mL容量瓶中，即得100μg/mL的標準樣品。用移液槍精密移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL的葡萄糖標準溶液分別置于試管中，定容至1 mL，分別加1.0 mL的6%苯酚，搖勻迅速滴加濃硫酸5mL，搖勻，在室溫下冷卻30 min，以空白校正零點。

1.2.2 多糖含量的測定

吸取提取出的樣品溶液，根據(jù)上述操作，測定樣品溶液的吸光度，將其帶入回歸方程，以計算多糖的含量。公式如下：

式中：C——樣液的濃度；

V——定容后的體積；

0.934——藍靛果多糖/總糖轉(zhuǎn)換系數(shù)；

m——所取藍靛果粉末的質(zhì)量；

n——稀釋倍數(shù)。

1.2.3 超聲輔助提取條件優(yōu)化

挑選果實成熟、果肉飽滿的藍靛果，干燥、粉碎。稱取2.00 g（準確稱量至±0.01 g） 的粉碎后的藍靛果粉末，按1∶15的料液比取蒸餾水溶解藍靛果粉末于燒杯中，后置于一定溫度（30，40，50，60，70℃）的超聲清洗器水浴中浸提一定時間（20，40，60，80，100 min），并設(shè)置超聲波清洗器功率（150，175，200，225，250W）。取1mL稀釋后的提取液，加入1mL苯酚，5mL硫酸，冷卻至室溫，在波長490 nm下測定吸光度A。計算藍靛果多糖濃度。

1.2.4 響應曲面分析

選取超聲溫度、超聲時間、超聲功率3個因素用Design-Expert 7.0.0進行Box-Behnken試驗[16]。

Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

如圖1所示，以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL） 為橫坐標，于波長490 nm下吸光度（A） 為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：Y=0.014 6X+0.002 1（R2=0.998 4）。

2.2 超聲輔助提取條件優(yōu)化分析

2.2.1 超聲時間對提取率的影響

在料液比1∶15，超聲溫度40℃，超聲功率175 W的提取條件下分別提取20，40，60，80，100min，在490 nm下測定吸光度A，通過標準曲線定量并計算。

超聲時間對提取率的影響見圖2。

從圖2可以看出，當超聲時間在20～60 min時，吸光度隨超聲時間的延長而增加，即提取的藍靛果含量隨超聲時間的延長而增加；繼續(xù)隨著超聲時間的延長吸光度呈下降趨勢，即藍靛果多糖的提取量呈下降趨勢。從圖2可以看出，超聲時間在60min時吸光度最高，即超聲時間60min時藍靛果多糖得率最大。由此可得，最佳的超聲時間為60min。

圖2 超聲時間對提取率的影響

2.2.2 超聲溫度對提取量的影響

在超聲時間60 min，超聲功率175 W，料液比1∶15的提取條件下分別用30，40，50，60，70℃的超聲溫度進行提??；在490 nm下測定吸光度，通過標準曲線定量并計算。

超聲溫度對提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對提取率的影響

從圖3可以看出，當超聲溫度在30～40℃時，吸光度隨超聲溫度的升高而增加，即提取的藍靛果多糖含量隨超聲溫度的升高而增加。這是由于藍靛果中的多糖能溶解到溶劑中，升高溫度使溶劑對多糖的提取能力增大（分子擴散作用），加快了提取速率，進而增加單位時間的提取量[17]。在超聲溫度為40℃時，吸光度達到最大，即所提取的藍靛果多糖含量最高。當超聲溫度高于40℃時，吸光度隨超聲溫度的升高而降低并趨平，即所提取的藍靛果多糖含量開始下降。由此可得，最優(yōu)提取溫度為40℃。

2.2.3 超聲功率對提取量的影響結(jié)果

在超聲時間60 min，超聲溫度40℃，料液比1∶15的提取條件下分別用 150，175，200，225，250W的功率進行提取；在490 nm下測定吸光度。

超聲功率對提取率的影響見圖4。

從圖4可以看出，當超聲功率在150～175W時，吸光度隨超聲功率的升高而而增加，即提取的藍靛果多糖含量隨超聲功率的升高而增加。這是由于功率增大能加劇空氣泡的運動，當超聲功率增加時，多糖提取率有所上升。在超聲功率為175W時，吸光度達到最大，即所提取的藍靛果多糖含量最高。當超聲功率高于175W時，吸光度隨超聲功率的升高而降低，即所提取的藍靛果多糖含量開始下降。由此可得，最佳超聲功率為175W。

圖4 超聲功率對提取率的影響

2.2.4 響應曲面分析結(jié)果

Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

表2中的數(shù)據(jù)通過Design Expert軟件進行擬合分析，藍靛果多糖提取率與3個變量之間的關(guān)系表述為以下二階多項式方程。

利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得超聲輔助提取藍靛果多糖對超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）和超聲功率（X3）的二次多項回歸模型方程為：

響應面模型方差分析見表3，回歸方程系數(shù)顯著性檢驗見表4。

從表3可見，試驗所選用的模型高度顯著（p＜0.000 1），模型的校正決定系數(shù)R2adj=0.972 1，說明該模型能解釋97.21%響應值的變化；相關(guān)系數(shù)R=0.993 9，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型是合適的，可以用此來分析超聲輔助藍靛果多糖的提取。從表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，模型一次項X1，X2，交互項X1X2，X1X3顯著；二次項 X12，v22，X32極顯著；X3，X2X3不顯著。

表3 響應面模型方差分析

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

超聲溫度與超聲時間對藍靛果多糖得率影響的響應曲面見圖5。

圖5 超聲溫度與超聲時間對藍靛果多糖得率影響的響應曲面

由圖5可以看出，在超聲功率為最佳值時，超聲溫度與超聲時間的交互作用對藍靛果多糖得率產(chǎn)生了顯著性影響。從等高線可以看出，隨著超聲溫度和超聲時間的增加，多糖得率也在增長；但超聲溫度大于40℃，超聲時間大于60 min后，超聲溫度和超聲時間的增加會導致藍靛果多糖得率的下降。

超聲功率與超聲時間對藍靛果多糖得率影響的響應曲面見圖6。

圖6 超聲功率與超聲時間對藍靛果多糖得率影響的響應曲面

由圖6可以看出，當超聲溫度為最佳條件時，超聲功率與超聲時間對藍靛果多糖的得率有顯著影響。藍靛果多糖得率隨著超聲功率和超聲時間的增加而增長，在超聲時間60 min，超聲功率175W時得率到達最大值，隨后藍靛果多糖得率隨超聲功率和超聲時間的增加而降低。

超聲功率與超聲溫度對藍靛果多糖得率影響的響應曲面見圖7。

由圖7可以看出，當超聲時間為最佳條件時，藍靛果多糖得率隨著超聲功率和超聲溫度的增加而增長，在超聲時間60 min，超聲溫度40℃時得率到達最大值，隨后藍靛果多糖得率隨超聲功率和超聲溫度的增加而降低。

由回歸方程解得中心點的最佳解為超聲時間67.17min，超聲溫度41.36℃，超聲功率175.08W，預測最大提取得率24.263%。

調(diào)整預測最佳提取參數(shù)，超聲時間67 min，超聲溫度41℃，超聲功率175W。在該條件下進行驗證試驗，所得結(jié)果為24.324%，模型與實際沒有顯著差異。

3 結(jié)論

圖7 超聲功率與超聲溫度對藍靛果多糖得率影響的響應曲面

以干燥后的藍靛果為原料，通過熱水浸提法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應面優(yōu)化試驗設(shè)計，探究超聲輔助提取藍靛果多糖的最佳工藝條件。單因素試驗選取超聲時間、超聲溫度和超聲功率3個因素進行研究，并設(shè)計三因素的響應面試驗。結(jié)果表明，單因素試驗中的最佳條件為超聲時間60min，超聲溫度40℃，超聲功率175W；通過響應面法得到最終提取工藝為超聲時間67min，超聲溫度41℃，超聲功率175 W，在此條件下藍靛果多糖得率為24.324%，與預測值相近，表明響應面法優(yōu)化的提取條件可行。

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