王 慧，藏印竹，武 靜，陳天琪

(貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550002)

谷氨酸(Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在的興奮性遞質(zhì)，谷氨酸作用的受體有兩類，一類是促離子型谷氨酸受體(包括NMDA受體、AMPA受體及Kainic acid受體)，另一類是促代謝型谷氨酸受體(mGluRs)，研究表明，mGluRs與睡眠-覺醒周期有非常重要的關(guān)系[1-4]。5-羥色胺(5-HT)是一個經(jīng)典的與睡眠和覺醒密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，它與腦內(nèi)其他神經(jīng)遞質(zhì)、受體有著密切的功能聯(lián)系，5-HT和Glu系統(tǒng)都能調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)的興奮性，但兩者是否有相互作用目前還不清楚。PCPA是5-HT合成酶-色氨酸羥化酶的抑制劑，能夠阻斷腦內(nèi)5-HT 的合成，減少腦內(nèi)5-HT的含量，從而使動物出現(xiàn)嚴重失眠[5]。本研究通過建立PCPA失眠模型大鼠，同時用酸棗仁湯進行干預(yù)，采用Real-time PCR法檢測大腦皮質(zhì)3組不同mGluR受體活動的變化及受體后cAMP/PKA信號通路活動變化情況，探索PCPA失眠機制中5-HT與Glu遞質(zhì)系統(tǒng)的關(guān)系，并從不同層次和水平揭示酸棗仁湯的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年清潔級SD雄性大鼠42只，體質(zhì)量200～220 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供(許可證號SCXK(渝)2007-0008)。置于安靜，溫度保持恒定(22±2) ℃，避免強光的環(huán)境中飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 藥物、主要試劑與器材 PCPA(DL-4-Chlorophenylalanine)(Sigma)，5-HTP(Sigma)，酸棗仁、知母、茯苓、川芎、甘草均購自貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院汪毅教授鑒定為正品。Trizol RNA提取試劑盒(Aidlab)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(GeneCopoeia)，RNase抑制劑(TransGen)，50×ROX Reference Dye(VAZVME)，All-in-one tm qPCR Mix(VAZVME)，Premix Ex Taq(TAKARA)，DL2000 DNA Marker(TAKARA)。實時熒光定量PCR儀(illumina eco)，熒光定量PCR管(illumina)，分光光度計(上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司)，PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 酸棗仁湯(SZRD)組成：酸棗仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，甘草3 g，稱取以上5味藥材386 g，加8倍量水浸泡1 h后煎煮，沸后30 min濾過，藥渣加6倍水煎煮，沸后20 min濾過，合并濾液濃縮成150%濃度的水提物，分裝滅菌，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。PCPA用生理鹽水配制成0.35 g/L的溶液，5-HTP用生理鹽水配制成2.5 mg/mL的溶液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 模型復(fù)制 根據(jù)本實驗室前期實驗結(jié)果(見參考文獻15)，按350 mg/kg體質(zhì)量以10 ml/kg體積腹腔注射PCPA，于每日上午8∶00～9∶00進行，每天1次，持續(xù)3 d，每日連續(xù)8 h(10∶00 am. 至 6∶00 pm.)觀察實驗動物的活動度，動物在第一次注射后30～32 h出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天也活動不停、躁動不安，表明模型復(fù)制成功。

1.2.3 動物分組與給藥方法 實驗動物按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、SZRD大劑量組、SZRD中劑量組、SZRD小劑量組、SZRD對照組、5-HTP組(5-HTP為5-HT合成的前體物質(zhì))7組各6只?？瞻讓φ战M第1、2、3天腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg)，從第1天下午2∶30～3∶30 pm(以下同)開始灌胃生理鹽水(10 ml/kg)，每天1次，連續(xù)7 d；模型組第1、2、3天腹腔注射PCPA(350 mg/kg)，從第1天下午開始灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d；酸棗仁湯大、中、小劑量組第1、2、3天腹腔注射PCPA，從第1天下午開始，SZRD 大、中、小劑量組分別給予15 g/(kg·d)、7.5 g/(kg·d)、3.75 g/(kg·d)的酸棗仁湯灌胃，給藥體積10 ml/kg，連續(xù)7 d；SZRD對照組第1、2、3天腹腔注射等體積生理鹽水，從第1天下午開始按7.5 g/(kg·d)的酸棗仁湯灌胃，連續(xù)7 d；5-HTP組第1、2、3天腹腔注射5-HTP(25 mg/kg)，從第1天下午開始灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

1.2.4 取材方法 各組末次給藥后，于次日上午8∶00給予過量戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，冰上快速取出大腦皮質(zhì)組織，放入做好標記的EP管中，置入液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA 表1顯示, 取-80 ℃冰箱中保存的新鮮冰凍組織50 mg，Trizol法提取RNA，紫外分光光度計測定OD值以計算RNA的純度和濃度。根據(jù)吸光光度值按下列公式計算樣品RNA的濃度：總RNA濃度(μg/μl)=OD260×40×200×10-3。將RNA加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(按試劑盒說明)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物為北京擎科生物公司合成。

表1 引物序列表

1.2.6 半定量RT-PCR檢測 反應(yīng)體系為內(nèi)參F (10 μmol/L)0.5 μL，內(nèi)參R (10 μmol/L)0.5 μL，dNTP (2.5 mmol/L)2 μL，Ex Taq0.25 μL，10×Ex Taq E buffer2.5 μL，cDNA 1μL，ddH2O加至 25 μL。反應(yīng)條件94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，30cycles；72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。PCR 產(chǎn)物電泳分析，瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增目的基因片段大小與設(shè)計的目的基因片段大小一致。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測 反應(yīng)體系為cDNA(10倍稀釋)4 μL，F(xiàn)orward Primer (100 μmol/L)0.4 μL，Reverse Primer (100 μmol/L)0.4 μL，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2×)10 μL，純水5.2 μL。反應(yīng)條件：50℃ 2 min， 95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般活動情況

在適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，所有大鼠晝夜節(jié)律正常，活動良好，進食飲水正常。大鼠在第1次注射PCPA后30～32 h出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天也活動不停、躁動不安，與空白對照組比較有明顯不同，表明模型復(fù)制成功。酸棗仁湯治療組與模型組比較，大鼠白天活動度減少，晝夜節(jié)律有明顯恢復(fù)。5-HTP組和酸棗仁湯對照組大鼠的白天活動度和睡眠情況與空白對照組比較無明顯改變。

2.2 PCPA對大腦皮質(zhì)mGlu1、mGlu2及mGlu7受體基因mRNA及受體后信號PKA、cAMPmRNA表達的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用

表2顯示，與空白對照組比較，PCPA模型組mGlu1、mGlu2及mGlu7受體mRNA表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；PCPA模型組PKA及cAMP mRNA表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

表2顯示，與模型組比較，酸棗仁湯大劑量組和中劑量組的mGlu1、mGlu2及mGlu7受體mRNA表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中大劑量組作用較強；而酸棗仁湯小劑量組上述mGlu受體的mRNA表達量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示酸棗仁湯對大腦皮質(zhì)mGlu1、mGlu2及mGlu7受體mRNA表達量改變呈現(xiàn)一定劑量的依賴性；酸棗仁湯大劑量組的PKA及cAMP基因mRNA表達量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P<0.05)；酸棗仁湯中劑量組PKAmRNA表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；小劑量組PKAmRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而酸棗仁湯中劑量組與小劑量組cAMP mRNA表達量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

酸棗仁湯對照組的mGlu1、mGlu2及mGlu7受體mRNA、受體后的PKAmRNA、cAMPmRNA表達量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。5-HTP組與空白對照組比較，皮質(zhì)的mGlu1、mGlu2mRNA表達顯著增加(P<0.05)，但mGlu7受體mRNA表達量變化無顯著性變化；PKAmRNA和cAMP mRNA的表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)mGluR1、mGluR2及mGluR7受體及受體后cAMP及PKAmRNA的表達量

注：與空白對照組比較：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001； 與模型組比較：※P<0.05，※※P<0.01，※※※P<0.001

3 討論

PCPA失眠模型是研究失眠機制及失眠藥物研發(fā)的常用實驗動物模型。實驗證實，腹腔注射PCPA能導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)5-HT濃度下降約80%[5]。PCPA大鼠失眠模型復(fù)制過程簡便，可重復(fù)性強，是目前國內(nèi)外較為公認的失眠模型。本實驗研究大鼠腹腔注射PCPA 后，白晝睡眠的晝夜節(jié)律消失，白天活動不停、躁動不安，顯示失眠大鼠造模成功。實驗發(fā)現(xiàn)，PCPA能導(dǎo)致皮質(zhì)組織mGluR1、mGluR2及mGluR7mRNA表達量明顯上升，酸棗仁湯能減少PCPA所致失眠動物的mGluR1、mGluR2及mGluR7mRNA表達量，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，同時PCPA能引起受體后PKA mRNA和cAMP mRNA表達量明顯下降。酸棗仁湯可使PCPA所致失眠動物大腦皮質(zhì)PKA mRNA和cAMP mRNA表達量上升，也表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。為檢測酸棗仁湯本身是否能引起皮質(zhì)代謝型谷氨酸受體及受體后信號活動變化，本實驗設(shè)立了酸棗仁湯對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸棗仁湯對正常大鼠mGluR1、mGluR2及mGluR7mRNA表達量及受體后PKA mRNA和cAMP mRNA表達量無顯著影響。

Glu是腦內(nèi)的興奮性遞質(zhì)，與睡眠-覺醒的關(guān)系密切。谷氨酸作用的受體有促離子型受體和促代謝型受體兩大類，腦內(nèi)的促離子型谷氨酸受體主要是調(diào)節(jié)快速的興奮性突觸傳遞，而代謝型谷氨酸受體(mGluR)主要是發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程。mGluRs 屬于G蛋白偶聯(lián)的谷氨酸受體，現(xiàn)已克隆出8種亞型，即mGluR1-8。根據(jù)其序列相似性及細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制又可分為3組，第1組由mGluR1、5組成，可通過G蛋白的介導(dǎo)作用直接與離子通道偶聯(lián)，抑制K+、Ca2+開放，使K+外流減少，從而使細胞緩慢去極化，增加細胞的興奮性。第2組和第3組分別由mGluR2、3和mGluR4、6、7、8組成，主要通過抑制性G蛋白(Gi)介導(dǎo)，抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，降低細胞內(nèi)cAMP含量發(fā)揮生物效應(yīng)[6]。

cAMP是經(jīng)典的第二信使，在信號傳導(dǎo)中，cAMP上游信號傳導(dǎo)分子主要包括G蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體和腺甘酸環(huán)化酶(AC)。其中G蛋白包括興奮性G蛋白(Gs)和抑制性G蛋白(Gi)。而cAMP下游信號傳導(dǎo)分子主要是蛋白激酶A(PKA)和蛋白磷酸酶。通常細胞內(nèi)cAMP水平升高，可以促進許多基因的表達，這些基因的調(diào)控序列中都含有一個由8肽核苷酸組成的順式反應(yīng)元件，即環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)。CREB位于細胞核內(nèi)，當配體與受體結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)，導(dǎo)致cAMP依存性蛋白激酶(PKA)的激活，PKA的4個亞基分離，其中催化亞基攜帶高能量進入細胞核，使核內(nèi)基因調(diào)節(jié)蛋白CREB磷酸化，生成CREB-1。CREB-1與DNA分子的cAMP反應(yīng)元件(CRE)結(jié)合，激活即刻反應(yīng)基因(IEG)，從而啟動新的蛋白(調(diào)節(jié)因子、受體、離子通道等)合成。因此，通過AC-cAMP-PKA信號通路的激活，神經(jīng)通路發(fā)生結(jié)構(gòu)上的精細修飾，使神經(jīng)元之間的信息傳遞功能發(fā)生變化。

本研究選取3種代謝型谷氨酸受體作為研究對象，即第1組的mGluR1、第2組的mGluR2和第3組的mGluR7。當PCPA造成腦內(nèi)5-HT合成量下降后，這3種受體基因的mRNA表達量增加，受體后cAMP mRNA和PKA mRNA表達量明顯下降。腦內(nèi)不同部位谷氨酸受體具有不同的作用，第1組mGluR的激活通常能減少腦內(nèi)不同部位的谷氨酸遞質(zhì)的釋放[7]。研究發(fā)現(xiàn)，mGlu1能監(jiān)測細胞外谷氨酸遞質(zhì)的濃度，通過負反饋調(diào)節(jié)谷氨酸的釋放，從而保持細胞外谷氨酸濃度的穩(wěn)定[8]。mGlu2受體能增強包括皮質(zhì)在內(nèi)的幾個神經(jīng)元群體NMDA受體的功能，不僅如此，mGlu2受體還能調(diào)節(jié)丘腦-皮層神經(jīng)環(huán)路的多種功能[9]。mGlu7廣泛分布在興奮性和抑制性突觸前，能調(diào)節(jié)谷氨酸和GABA遞質(zhì)的釋放[10]，并在睡眠調(diào)節(jié)中起重要作用[11]。最新的研究還表明，mGlu7還參與了學(xué)習與記憶的功能[12]。由于代謝型谷氨酸受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用，極有可能成為藥物作用的靶點[13]。有研究表明，PCPA能導(dǎo)致丘腦Glu遞質(zhì)含量增加[14]。本實驗室前期的實驗發(fā)現(xiàn)，PCPA失眠大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞被激活[15]，而神經(jīng)膠質(zhì)細胞與腦內(nèi)的Glu具有密切的功能聯(lián)系，實驗證實膠質(zhì)細胞可以釋放Glu[16]，因此PCPA所致腦內(nèi)5-HT合成障礙可能導(dǎo)致Glu遞質(zhì)釋放異常增加，引起mGlu受體活動變化，抑制受體后信號通路cAMP和PKA基因的表達，并通過這種途徑調(diào)節(jié)Glu的釋放。酸棗仁湯可作用于PCPA失眠大鼠大腦皮質(zhì)mGlu1、mGlu2和mGlu7受體，并影響受體后cAMP/PKA信號通路活動，這可能是酸棗仁湯臨床療效作用機制的環(huán)節(jié)之一。5-HTP為5-HT合成的前體物質(zhì)。本實驗發(fā)現(xiàn)，5-HTP能引起mGlu1和mGlu2受體活動發(fā)生變化，導(dǎo)致受體后cAMP/PKA信號通路活動改變，但對mGlu7受體活動沒有顯著影響，提示其作用可能與mGlu7受體活動關(guān)系不大。神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)的轉(zhuǎn)化及作用機制復(fù)雜，PCPA和5-HTP對代謝型谷氨酸受體及受體后信號基因表達的作用并沒有顯示完全相反的效應(yīng)。且最近研究表明，PCPA所致失眠大鼠可出現(xiàn)血清中內(nèi)分泌激素水平的異常變化[17-19]，如促腎上腺皮質(zhì)激素含量的下降，褪黑素、甲狀腺素水平的增加等，這些激素都與大腦皮質(zhì)興奮性活動密切相關(guān)。PCPA所致腦內(nèi)的5-HT含量下降與這些激素分泌的調(diào)節(jié)具有關(guān)聯(lián)性，但腦內(nèi)5-HT的變化是如何與上述激素水平的調(diào)節(jié)系統(tǒng)相互作用，這些激素分泌的調(diào)節(jié)是否與腦內(nèi)谷氨酸受體的活動有關(guān)？其具體機制值得進一步的研究。

綜上所述，腦內(nèi)5-HT合成障礙能導(dǎo)致大腦皮質(zhì)mGlu1、2、7受體mRNA及受體后信號分子cAMP和PKA mRNA表達變化，酸棗仁湯對上述變化具有明顯的干預(yù)作用。本研究為新型失眠藥物的研發(fā)及酸棗仁湯的臨床運用提供了實驗依據(jù)。

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