雷 鳴，李偉寧，姚 斌，邵文超，張曉杰△

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250014； 2. 寧夏銀川市中醫(yī)醫(yī)院，寧夏 銀川 750001； 3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014； 4. 寧夏中寧縣中醫(yī)院，寧夏 中寧 755100； 5. 寧夏賀蘭縣中醫(yī)醫(yī)院，寧夏 賀蘭 750200)

銀屑病(Psoriasis)又名“牛皮癬”，是一種常見且極易復(fù)發(fā)的慢性炎性皮膚病，主要病理表現(xiàn)為表皮角化過(guò)度、角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生[1-2]，其病因尚未明確。新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞Th17亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子與該病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。原始T細(xì)胞在TGF-β和IL-6的作用下向Th17細(xì)胞分化，成熟的Th17細(xì)胞分泌IL-23和IL-17，前者正反饋促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化成熟并維持其穩(wěn)定性[5-6],后者與其相應(yīng)受體結(jié)合后激活下游p38MAPK信號(hào)通路[7]，繼而上調(diào)IL-6的表達(dá)。此外，IL-17還可通過(guò)上調(diào)IL-8的表達(dá)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞在銀屑病皮損處聚集引起表皮過(guò)度角化[8]。那么龍膽瀉肝湯加減治療銀屑病是否通過(guò)p38MAPK/IL-17信號(hào)通路發(fā)揮作用，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究就尋常型銀屑病患者皮損中p38MAPK基因水平及患者口服龍膽瀉肝湯加減治療前后外周血Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

基因檢測(cè)部分：10例銀屑病患者來(lái)自于我院皮膚科門診2015年1月至4月就診患者，其皮損取自于我院皮膚科門診行病理檢測(cè)(經(jīng)皮損表現(xiàn)和病理報(bào)告均證實(shí)為銀屑病)的皮膚組織(病理結(jié)果見附圖)，對(duì)照組皮膚組織取自外科手術(shù)患者切除的正常皮膚。

臨床實(shí)驗(yàn)部分： 2015年5月至2016年4月就診我院皮膚科門診的42例經(jīng)龍膽瀉肝湯加減治療尋常型銀屑病患者，其中男18例，女24例，年齡18～58歲，平均年齡(39.4±2.3)歲;病程3個(gè)月～20年，平均病程(12.8±1.3)年。皮損嚴(yán)重指數(shù)(PASI)評(píng)分按標(biāo)準(zhǔn)[9]計(jì)算14.3～28.4分，平均(19.37±2.32)分。健康對(duì)照組30例來(lái)自我院體檢者，其中男16例，女14例，年齡22～57歲，平均年齡(36.1±3.3)歲。2組性別、年齡等資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器和試劑

ELISA試劑盒(北京索萊寶)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(00255982，Thermo)，PCR試劑(appled biosystems)，TRNzol Reagent(DP405，天根)， PCR儀(T100TM，Bio-Rad)，電泳成像系統(tǒng)(Tanon1600，天能)，酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo)。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)[10-11]

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有典型臨床表現(xiàn)，皮損以丘疹、斑丘疹和大小不等的紅色斑塊上覆有多層干燥銀白色鱗屑皮疹，刮去鱗屑可見一層光亮薄膜，薄膜下可見點(diǎn)狀出血，進(jìn)行期不斷有新皮疹出現(xiàn)，有同形反應(yīng)；皮損形態(tài)可為點(diǎn)滴狀、斑塊狀、錢幣狀、地圖狀、混合狀等類型；本病經(jīng)過(guò)緩慢，有自限性、易復(fù)發(fā)，可伴有不同程度的瘙癢；好發(fā)于頭皮、四肢伸側(cè)及腰骶部。發(fā)于頭皮者，毛發(fā)呈束狀；發(fā)于甲板(指、趾)者，可有頂針樣凹陷或前沿剝離；病理符合銀屑病角化不全、角化過(guò)度、Munro微膿瘍；棘層增厚，表皮突下延；真皮乳頭上伸接近角質(zhì)層，真皮上層血管擴(kuò)張，血管內(nèi)皮增生，周圍有圓形細(xì)胞浸潤(rùn)。

中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：主癥：皮損鮮紅；新出皮疹迅速擴(kuò)大或者不斷增多。次癥：心煩易怒；小便黃；舌質(zhì)紅或絳；脈弦滑或數(shù)。具備所有主癥和1項(xiàng)以上次癥即可診斷。

1.4 方法

1.4.1 p38MAPK基因檢測(cè) 根據(jù)p38MAPK和GAPDH基因序列設(shè)計(jì)并合成PCR物:p38MAPK-F: CTCCATAATGGCCGAGCTGT，p38MAPK-R: CC TGTTCTGTCGCGAT；GAPDH-F:AAATCCCATCACCATCTTCC，GAPDH-R:CTGCCCTTT GGCC。提取銀屑病患者皮損處皮膚組織和外科手術(shù)切取的正常皮膚組織總RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，以 cDNA 為模板，PCR法檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。

1.4.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 分別采取健康對(duì)照者和銀屑病患者經(jīng)龍膽瀉肝湯加減治療前后外周血4 mL，待其自然凝固后離心取上清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23及TGF-β的表達(dá)情況。

1.4.3 治療方法 龍膽瀉肝湯加減方：金銀花12 g，土茯苓30 g，柴胡9 g，龍膽草9 g，山梔子9 g，黃芩9 g，蒲公英30 g，生地黃15 g，車前子(包煎)15 g，當(dāng)歸9 g，澤瀉9 g，丹皮15 g，甘草6 g，連翹15 g。水煎取汁400 mL，分2次于早、晚飯后1 h溫服，7 d為1個(gè)療程，共4個(gè)療程。

1.4.4 PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]按患者皮損面積和嚴(yán)重程度進(jìn)行PASI評(píng)分：皮損嚴(yán)重程度按照有無(wú)紅斑、浸潤(rùn)、鱗屑分為無(wú)、輕、 中、重、極重，分別計(jì)0～4分; 皮損面積按照無(wú)皮損、皮損面積 <10%、 10%～30%、 30%～50%、50%～70%、70%～90%、90%～100%分別計(jì)0～6分。PASI總分=(0.1×頭部皮損面積損×嚴(yán)重程度)+(0.2×上肢皮損面積損×嚴(yán)重程度)+(0.3×軀干皮損面積損×嚴(yán)重程度)+(0.4×下肢皮損面積損×嚴(yán)重程度)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基因檢測(cè)結(jié)果

10例銀屑病患者與健康對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果。

2.1.1 p38MAPK基因表達(dá)情況 圖1顯示，與健康對(duì)照組比較，10例銀屑病患者皮損處p38MAPK基因表達(dá)水平均有不同程度的增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

圖1 PCR檢測(cè)10例銀屑病患者皮損處與健康對(duì)照組p38MAPK 基因的表達(dá)情況注：與健康對(duì)照組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.1.2 p38MAPK基因與PASI 評(píng)分相關(guān)性分析 10例銀屑病患者皮損處p38MAPK基因表達(dá)水平與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.853，P<0.01)。

2.1.3 外周血IL-17、IL-6表達(dá)情況 表1顯示，與健康對(duì)照組比較，10例銀屑病患者外周血中細(xì)胞因子IL-17、IL-6含量均升高，且升高程度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.1.4 患者p38MAPK基因與IL-17、IL-6相關(guān)性分析 表2顯示，10例銀屑病患者外周血IL-17、IL-6的含量與患者皮損處p38MAPK基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.01)。

表1 10例銀屑病患者與健康對(duì)照組外周血細(xì)胞因子IL-17、IL-6表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較:**P<0.01

表2 10例銀屑病患者外周血細(xì)胞因子IL-17、IL-6與皮損處p38MAPK基因相關(guān)性分析

2.2 臨床實(shí)驗(yàn)部分

42例經(jīng)龍膽瀉肝湯加減治療銀屑病患者與健康對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果。

2.2.1 患者治療前后PASI 評(píng)分比較 治療前患者PASI評(píng)分(19.37±2.32)分，經(jīng)龍膽瀉肝湯加減治療4個(gè)療程后，患者PASI評(píng)分(4.76±1.30)分較治療前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2.2 患者治療前后與健康對(duì)照組5種細(xì)胞因子表達(dá)情況 表3顯示，與健康對(duì)照組比較，銀屑病患者外周血相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23以及TGF-β表達(dá)水平均有不同程度升高(P<0.05)，經(jīng)龍膽瀉肝湯加減治療4個(gè)療程后，患者外周血中各細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。

表3 各組樣本外周血5種細(xì)胞因子表達(dá)比較

注：通過(guò)Levene方差齊性檢驗(yàn)得出，3組數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P=0.824>0.05)，故均采用One-way ANOVA檢驗(yàn)對(duì)3組之間進(jìn)行比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2.3 治療組患者治療前后5種細(xì)胞因子與PASI 評(píng)分相關(guān)性分析 表4顯示，銀屑病患者治療前后外周血5種細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、IL-17、IL-23和TGF-β)的表達(dá)水平均與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05，P<0.01)。

表4 銀屑病患者治療前后外周血5種細(xì)胞因子表達(dá)水平與PASI評(píng)分相關(guān)性分析

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚疾病[1]，其病因復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于該病的病因多從遺傳、感染、精神、代謝障礙以及免疫異常等方面論述[12]，而免疫功能紊亂在銀屑病中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。既往研究認(rèn)為，Th1/Th2比例失衡是導(dǎo)致銀屑病發(fā)生的重要因素[2]，但近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)一種CD4+T細(xì)胞Th17亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子在銀屑病中所發(fā)揮的作用引起人們的重視[3-4]。原始T細(xì)胞在TGF-β和樹突狀細(xì)胞(CD細(xì)胞)分泌IL-6的誘導(dǎo)下向原始Th17細(xì)胞分化，IL-23則在其后期分化成熟和維持其穩(wěn)定過(guò)程中發(fā)揮重要作用。成熟以后的Th17細(xì)胞分泌IL-23和IL-17，IL-23正反饋促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化成熟[5-6]，而IL-17與其相應(yīng)的受體結(jié)合可激活p38MAPK[7]。p38MAPK在銀屑病患者非皮損區(qū)及正常人表皮中主要表達(dá)于胞漿，而在銀屑病患者皮損處被磷酸化激活后轉(zhuǎn)移細(xì)胞核內(nèi)活化多種核轉(zhuǎn)錄因子和其他激酶，繼而上調(diào)IL-6的表達(dá)[13]，進(jìn)一步誘導(dǎo)原始T細(xì)胞向Th17亞群分化。此外，IL-17還可以通過(guò)上調(diào)IL-8的表達(dá)誘導(dǎo)大量炎性細(xì)胞在銀屑病皮損處聚集，引起角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖，促進(jìn)皮損的發(fā)生[8]，說(shuō)明p38MAPK/IL-17信號(hào)通路在銀屑病發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。

中醫(yī)藥對(duì)銀屑病的治療具有注重整體觀念、辨證施治、副作用小等特點(diǎn)，尚有一定的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)學(xué)對(duì)銀屑病早有“松皮癬、干癬”的記載。情志不暢，而肝失疏泄，“五臟有病，則各傳其所勝”，木旺克土引起土衰，土衰則制水不及而至水盛。脾升胃降，有賴于肝之疏泄，而肝失疏泄則可使脾失健運(yùn)、水濕內(nèi)生、郁而化熱、濕熱蘊(yùn)于肌表而為病。此類患者皮疹潮紅或有糜爛，皮屑多而黏厚，瘙癢無(wú)度，兼有脅痛口苦目眩、小便黃赤、飲食不振、脘痞等癥狀。故選用《醫(yī)方集解》之龍膽瀉肝湯為基礎(chǔ)方，在此基礎(chǔ)上去木通加以金銀花、土茯苓，其中以龍膽草上清肝經(jīng)實(shí)火、下瀉肝經(jīng)濕熱，金銀花清熱解毒共為君藥，澤瀉、車前子助龍膽草下瀉肝膽濕熱，黃芩、土茯苓助金銀花清熱解毒，白芍、當(dāng)歸養(yǎng)血而柔肝，諸藥共用可清肝之實(shí)火，瀉肝之濕熱，健脾除濕而消疹。通過(guò)現(xiàn)代藥理分析表明，龍膽瀉肝湯加減方具有很多有效成分，作用較為廣泛，主要體現(xiàn)在抗病原微生物、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制表皮細(xì)胞增生、止癢、調(diào)節(jié)代謝障礙以及保肝、利尿等方面[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損處p38MAPK基因與患者外周血中Th17相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯增高，其增高程度與患者PASI評(píng)分密切相關(guān)，說(shuō)明三者之間相互影響，在銀屑病發(fā)生發(fā)展以及患者皮損形成過(guò)程中起到極其重要的作用。經(jīng)龍膽瀉肝湯加減方治療后，患者外周血5種細(xì)胞因子的表達(dá)水平有所下降，同時(shí)患者PASI評(píng)分也顯著降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明龍膽瀉肝湯加減治療銀屑病臨床療效顯著，值得推廣?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，可以考慮將銀屑病患者皮損處p38MAPK基因以及外周血中Th17相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)作為臨床評(píng)估銀屑病嚴(yán)重程度及患者預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)不足之處只是單純檢測(cè)治療前P38MAPK蛋白的表達(dá)，因臨床條件及皮損取材所限，無(wú)法對(duì)銀屑病患者治療后皮損P38MAPK蛋白表達(dá)的檢測(cè)。在下一步的研究中，希望能通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確龍膽瀉肝湯加減方治療銀屑病的作用機(jī)制。

[1] 趙辨.臨床皮膚病學(xué)[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001:759.

[2] 盛國(guó)榮,謝勇,劉海琴.退銀湯聯(lián)合窄譜中波紫外線治療尋常型銀屑病的療效及對(duì)外周血相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2014,34(7):576-580.

[3] ANNUNZIATO F, COSMI L, SANTARLASCI V, et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells[J]. J Exp Med,2007,204(8):1849-1861.

[4] 葉萍,黃偉林,鄭力.Th17細(xì)胞相關(guān)因子與尋常型銀屑病的相關(guān)性研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2013,42(15):1706-1707.

[5] ACOSTA-RODRIGUEZ EV, NAPOLITANI G, LANZAVECCHIA A, et al. Inter-leukins 1beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells[J].Nat Immunol,2007,8(9):942-949.

[6] KAGAMI S. IL-23 and Th17 cells in infection and psoriasis[J]. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi,2011,34(1):13-19.

[7] ATHANASLOS MAVROPOULOS,et al. The Role of p38MAPK in the Aetiopathogenesis of Psoriasis and Psoriatic Arthritis[J]. Clinical and Developmental Immunology,2013:8-13.

[8] FOSSIEZ F, DJOSSOU O, CHOMARAT P, et al. T cell interleukin17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines[J]. J Exp Med,1996,183(6):2593-2603.

[9] KIRBY B, FORTUNE DG, BHUSHAN M, et al. The Salford Psoriasis Index: an bolistic measure of psoriasis severity[J]. Br J Dermatol,2000,42(4):728-732.

[10] 趙辨,張振楷,倪容之，等.臨床皮膚病學(xué)[M].3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001:759-760.

[11] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)皮膚病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)[M].1995.

[12] 李曰慶.中醫(yī)外科學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2009:183.

[13] C JOHANSEN, K KRAGBALLE, M WESTERGAARD, et al. The mitogen-activated protein Kinases p38 and ERK1/2 are increased in Iesional psoriatic skin [J]. British Journal of Dermatology,2005,152(1):37-42.