陸荷微， 劉斌美， 陶亮之， 葉亞峰， 吳振宇， 范 爽， 吳躍進， 王 鈺

(1. 安徽大學 資源與環(huán)境工程學院, 合肥 230601; 2. 中國科學院合肥物質科學研究院 技術生物與農業(yè)工程研究所, 合肥 230031)

水稻脆性突變體是一種經典的形態(tài)學突變，植株的莖稈和葉片等組織脆性增加，是水稻突變類型中常見的一種[1]。機械強度作為莖稈的重要特性之一，直接關系植株后期的抗倒伏情況[2]。脆性突變一方面會導致莖稈強度的減弱，進而降低其支撐力，倒伏風險增大，所以一般認為脆性突變對水稻的田間管理和收獲生產是不利的；但是另一方面纖維素含量降低，木質素含量升高，營養(yǎng)成分改變，對反芻動物反而口感好、易消化，所以將水稻脆性突變體發(fā)展成一種稻飼兼用型水稻，在提高秸稈資源的利用率等方面具有很大的應用前景[3-5]。

物理誘變是獲得水稻脆性突變的一個重要途徑，吳躍進等利用低能離子束和重離子等物理平臺創(chuàng)建一系列水稻脆性突變體，豐富了脆性突變體遺傳資源[6-7]。劉斌美等利用離子束誘變技術，在秈稻9311中分離1個莖、葉均表現脆性的bc9311-1突變體，通過細胞壁組分檢測和組織解剖的掃描電鏡觀察研究了bc933-1的生物學特性[8]。葉亞峰等在氮離子束誘變的突變體中發(fā)現一脆稈矮生突變體dfr并完成控制該脆性性狀基因的定位研究[9]。從目前的研究來看，水稻脆性性狀的發(fā)生和細胞壁主要成分的改變關系密切，纖維素含量降低，木質素含量升高以及其他多種組分變化的結合作用影響了細胞壁的生物合成，進而改變植株的支撐情況。因此，在選育水稻品種時利用物理技術創(chuàng)建和發(fā)掘新的脆性突變材料對研究細胞壁形成機理以及莖稈機械支撐力與細胞壁主要成分含量的關系有著重要的價值。

本研究圍繞通過重離子輻照粳稻品種wyj7獲得的水稻脆性突變體w7bc5的農藝與經濟特征，細胞壁主要成分，抗折力和莖稈中可溶性糖含量等展開，進而為揭示該突變體的脆性機制及深入研究和應用奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻材料：2015年，利用重離子輻照誘變粳稻品種wyj7獲得一水稻脆性突變體，暫命名為w7bc5，其莖稈和葉片手折脆弱易斷。

材料種植：實驗水稻材料正季(5月—11月)均種植于合肥物質科學研究院水稻育種實驗基地(117°18′E，31°52′N)。水稻南繁(當年12月至翌年4月)材料均種植于海南省三亞市實驗基地(109°49′E，18°34′N)。

1.2 方法

1.2.1 農藝性狀分析

在田間隨機取15株(取樣時注意避取邊行株)成熟期供試水稻材料，考察其主要農藝特征和經濟性狀，包括：全生育期、株高、穗長、分蘗數、每穗粒數、千粒重及結實率等。

1.2.2 細胞壁組分含量的分析

根據Van Soest等[10]方法測定細胞壁組分含量。取抽穗期的水稻材料，將莖稈和葉片分開，剪成合適的長度放入65℃烘箱中,待完全烘干后取出，用旋風磨分別將莖稈和葉片粉碎，粉末裝入干凈的封口袋中以備后續(xù)實驗所用。

1.2.3 莖稈抗折力的測定和倒伏指數的計算

莖稈抗折力(resistance snapping, RS)的測定參考楊惠杰[11]的方法。田間取回抽穗后35 d的水稻，將完整水稻莖稈放入水槽中保持其不失水，注意保留莖稈外部葉鞘及葉片。將待測水稻莖稈第二節(jié)間置于兩塊約7 cm左右的寬板中間，保持莖稈的水平狀態(tài)，將數顯示推拉力計掛于莖稈中間部位，垂直向下輕輕拉動測力儀，由于該儀器可記載推拉過程中的最大數值，所以當莖稈折斷彎曲45°以上時，測力儀上的數值就是莖稈基部第二節(jié)間對應的抗折力(N)。從田間取回的水稻樣品放置實驗室內極易失水皺縮，因此盡量保證所有試驗材料在當天測定完畢。

倒伏指數(lodging index, LI)={[第2節(jié)間基部至穗頂長度(cm)×第2節(jié)間基部至穗頂鮮重(g)] / 抗折力}×100。倒伏指數越大，表示植株越容易倒伏，倒伏指數臨界值為200[12]。

1.2.4 不同生長時期水稻莖稈中可溶性糖含量的測定

水稻不同時期莖稈中可溶性糖含量的測定參照蒽酮比色法[13]。

1.3 分析方法

采用SAS 8.0對本文試驗數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 w7bc5突變體的表型特征

突變體w7bc5在整個生長過程中都表現脆性，莖稈相較于野生型明顯變脆(圖1)，在田間易于用手折方式辨別其脆性性狀。兩者在其他表型特征上幾乎一致。

圖1突變體w7bc5和野生型wyj7植株莖稈抗折情況

性狀突變體w7bc5野生型wyj7Characteristicsmutantw7bc5wildtypewyj7生育期growthperiod124125株高plantheight(cm)947±169515±105穗長paniclelength(cm)1539±0721548±093分蘗數tillernumberperplant105±04110±027每穗粒數numberofgrainperpanicle10894±56712045±325?千粒重thousandseedweight(g)2334±02628095±0125?結實率seedfertility(%)92±0689683±19?

注：*表示顯著差異(P<0.05)；下同

2.2 w7bc5突變體農藝性狀分析

如表1所示：突變體w7bc5和野生型wyj7的全生育期和株高相近，每穗粒數有所減少，千粒重和結實率也有下降，其他性狀差異不明顯，可以看出突變體w7bc5的農藝經濟特征較好。

2.3 細胞壁組分含量的分析

分別測定w7bc5突變體和wyj7野生型莖稈、葉片的細胞壁各主要組分含量。結果(圖2)顯示野生型wyj7莖稈中纖維素的含量為31.34%，而脆性突變體w7bc5的是22.97%，減少了26.7%；野生型wyj7莖稈中半纖維素含量為18.9%，突變體w7bc5的是27.48%，顯然w7bc5半纖維素含量顯著提高；而兩者木質素含量相當，差異不明顯。木質纖維素含量的變化導致突變體w7bc5和wyj7細胞壁結構的變化，從而導致外部的脆性特征，這也與相關的研究[14]結果是一致的。

圖2 野生型wyj7和突變體w7bc5莖稈細胞壁組成成分含量分析

由圖3不難發(fā)現，w7bc5與wyj7水稻葉片中木質纖維素含量的變化趨勢與莖稈中的是一致的，纖維素含量顯著降低，半纖維素含量升高，而木質素和無機鹽含量未表現明顯差異。由此也可以看出，在對細胞壁結構的影響中，纖維素和半纖維素含量的變化較為明顯。

圖3 野生型wyj7和突變體w7bc5葉片細胞壁組成成分含量分析

Fig 3 Difference of leaf cell wall components between wild typewyj7 and mutantw7bc5

2.4 抽穗后水稻脆莖突變體w7bc5的物理特性

莖稈的機械強度是水稻重要的物理特性之一，機械強度的改變導致莖稈出現脆嫩易折的特性，影響植株支撐力。我們取了抽穗后35 d左右的兩種水稻材料，分別進行了莖稈抗折力的測定以及倒伏指數的計算(表2)。從w7bc5與野生型wyj7莖稈基部第二節(jié)間抗折力的測定結果來看，w7bc5比wyj7降低了約29.8%，這與田間觀察兩者莖稈手折即斷的程度相符，突變體所需的折斷力明顯減小。以倒伏指數為指標綜合評價脆性突變體w7bc5與野生型水稻后期可能存在的倒伏風險，突變體w7bc5與野生型水稻的倒伏指數都不是很大，且都小于倒伏指數的臨界值200[12]，該結果也與田間的實際觀察情況保持一致。因此，突變體w7bc5具有良好的抗倒伏特性，便于田間收獲和管理。

表2 突變體w7bc5與野生型wyj7的物理特性

2.5 水稻不同生育期莖稈的可溶性糖含量

由表3可以看出，突變體w7bc5與野生型wyj7莖稈中可溶性糖含量在拔節(jié)期與抽穗期的差異并不顯著，而后兩者的差距由抽穗期的12.8 mg/g擴大到成熟期的62.9 mg/g，成熟期突變體莖稈中可溶性糖含量顯著低于野生型，可見突變體在抽穗之后莖稈中的可溶性糖可能更多地轉運去籽?；蚱渌M織中，導致在此過程中莖稈充實度下降，抗折力減小，最終引起脆性性狀的表達。

表3 突變體w7bc5與野生型wyj7不同時期可溶性糖含量

注：通過Duncan檢驗，同列不同小寫字母表示兩個材料之間的差異顯著(P<0.05)

3 討論

水稻脆性性狀的發(fā)生涉及多個復雜的生理生化過程，目前對其機理的研究已經有了新的進展，但是具體的脆性發(fā)生機制還不是很清晰。本文研究的重離子輻照粳稻wyj7獲得的一個脆性突變體w7bc5，與野生型相比，該突變體的發(fā)育生長未受到較大的影響，產量相關經濟性狀較為優(yōu)良。目前在水稻脆性突變已有的報道中，莖稈和葉片等其他組織脆嫩易折的性狀大部分與木質纖維素的合成有關，細胞壁主要成分含量的改變導致其結構的變化[15]。纖維素是細胞壁的主要成分，是細胞骨架的基礎，它起到控制細胞大小和維持細胞形態(tài)的重要作用，在遭遇外界壓力的時候給予植株機械支撐力[16]。w7bc5突變體葉片和莖稈的纖維素含量比野生型wyj7的都要低，半纖維素含量有所升高，且差異顯著，木質素、無機鹽含量并沒有明顯差異，從中可以看出木質纖維素含量的改變導致植株脆性性狀的發(fā)生。從不同時期水稻莖稈中可溶性糖含量來看，脆性突變體w7bc5可溶性糖含量從拔節(jié)期后一直小于野生型品種，成熟期差異達到最大。研究表明，可溶性糖含量的降低可能改變了莖稈的充實度，從而影響了莖稈的抗折性，中空的結構或不充實的組織更容易引起脆性的表現[17]。但是鑒于水稻脆性性狀的發(fā)生原因涉及多種莖稈生化成分的變化，所以還要進一步從莖稈形態(tài)結構、不同生育期莖稈硅、鉀、鈣、鎂含量以及后期莖稈含水等方面進行深入研究[18]。

通過重離子誘變獲得一系列的水稻脆性突變體，這些突變體為研究水稻細胞壁的生物合成提供寶貴的材料[19]。創(chuàng)建和發(fā)掘新的脆性突變體對于闡明水稻莖稈支撐力改變的發(fā)生過程同樣具有重大意義[20-22]。水稻秸稈數量多，體積大，自然狀態(tài)下降解速率緩慢，秋收季節(jié)秸稈焚燒隨處可見，造成嚴重環(huán)境污染和資源浪費。通過重離子輻照誘變的脆性突變體莖稈和葉片變脆，收獲時易破碎降解，減少機器耗能和損傷，更有利于水稻秸稈的自然還田。同時還可以將脆性材料直接作為家畜飼料，其較低的纖維素含量對反芻動物更易消化。木質纖維素的含量與莖稈的抗折力大小密不可分，直接影響植株的脆性特征，由于纖維素等主要成分含量的改變，植株莖稈、葉片等變脆，通過手折等方法容易在田間鑒別，因此在遺傳育種實踐中發(fā)現脆莖突變的概率遠遠高于發(fā)現莖稈堅硬的突變材料，所以注意田間選擇應該可以發(fā)現更多類型的細胞壁合成突變材料。同時通過選擇適當變化的突變材料，為適合秸稈還田、新株型、生物質能源、稻飼兼用等作物育種提供目標性狀，從而進一步發(fā)掘新種質的應用價值。

[1]張水金,鄭 軼,朱永生,等.水稻脆性突變體研究進展[J].福建農業(yè)學報,2011,26 (5):895-898.

[2]WANG H F, WU Y M, LIU J X, et al. Morphological fractions, chemical compositions and in vitro gas production of rice straw from wild and brittle culm J variety harvested at different growth stages[J].Animal Feed Science and Technology, 2006, 129(1-2):159-171.

[3]吳 超,朱 麗,林 鳳,等.水稻脆莖突變體的研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2007,35 (17):5085-5086.

[4]李文麗,吳先軍.一個水稻脆稈突變體的遺傳分析與基因定位[J].核農學報,2006,20 (6):500-502.

[5]彭良才.中國生物能源發(fā)展的根本出路[J].華中農業(yè)大學學報(社會科學版),2011(2):1-6.

[6]劉斌美,吳躍進,童繼平,等.水稻顯性半矮稈基因的SCAR標記及初步定位[J].作物學報,2006,32 (3):449-454.

[7]許 學,劉斌美,宋 美,等.氮離子束與γ 射線輻照日本晴和“9311”水稻突變體的篩選[J].核農學報,2008,22 (4):389-393.

[8]劉斌美,葉亞峰,章忠貴,等.一個秈稻脆性突變體的生物學特性及基因定位研究[J].植物遺傳資源學報,2011,12(5):259-264.

[9]葉亞峰,劉斌美,許 學,等.水稻脆稈矮生突變體鑒定及基因定位研究[J].核農學報,2012,26(1): 1-5.

[10]VAN SOEST P J, ROBERTSON J B, LEWIS B A. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition[J]. Journal of Dairy Science, 1991, 74(10):3583-3597.

[11]楊惠杰,楊仁崔,李義珍,等.水稻莖稈性狀與抗倒伏能力的關系[J].福建農業(yè)學報,2000,15 (2):1-7.

[12]OOKAWA T, ISHIHARA K. Varietal difference of physical characteristic of the culm related to lodging resistance in paddy rice[J]. Japan Journal Crop Science,1992, 61(3):419-425.

[13]張志良,翟偉菁,李小方.植物生理學實驗指導[M].北京：高等教育出版社,2005,127-128.

[14]馮永清,鄒維華,李豐成,等.特異水稻脆莖突變體生物學特性及生物質降解效率的研究[J].中國農業(yè)科技導報,2013,15 (3):77-83.

[15]ZHONG R, YE Z H. The Arabidopsis NAC transcription factor NST2 functions together with SND1 and NST1 to regulate secondary wall biosynthesis in fibers of inflorescence stems[J]. Plant Signal Behav, 2015, 10(2):e989746.

[16]ZHONG R, YE Z H. Secondary cell walls: biosynthesis, patterned deposition and transcriptional regulation[J]. Plant & Cell Physiology, 2015, 56(2):195 214.

[17]ZHAO Y, SU J, XU P, et al. Intron-mediated alternative splicing of wood-associated NAC transcription factor1B regulates cell wall thickening during fiber development inPopulusspecies[J]. Plant Physiology, 2014, 164(2):765-776.

[18]YOSHIDA K, SAKAMOTO S, KAWEI T, et al. Engineering theOryzasativacell wall with rice NAC transcription factors regulating secondary wall formation[J]. Frontiers in Plant Science, 2013, 4:383.

[19]ZHANG B, ZHOU Y. Rice brittleness mutants: a way to open the black box′ of monocot cell wall biosynthesis[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2011, 53 (2):136-142.

[20]HIRANO K, KOTAKE T, KAMIHARA K, et al. Rice brittle culm3(BC3) encodes a classical dynamin OsDRP2B essential for proper secondary cell wall synthesis[J]. Planta, 2010, 232 (1):95-108.

[21]全東興,韓龍植,南鐘浩,等.特種稻種質資源研究進展與展望[J].植物遺傳資源學報,2004,5 (3):227-232.

[22]汪海峰,朱軍莉,劉建新,等.飼喂脆莖全株水稻對生長肥育性能、養(yǎng)分消化和胴體品質的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報,2005, 36 (11):1139-1144.