朱江+何文姬+李翠蓮++郭貴唐++楊光能++張楨
[摘要]目的 臨床上建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定兒童血漿中維生素E含量的方法。方法 取兒童血漿200 μl,按v/v為8∶2的比例加入甲醇和異丙醇140 μl,渦旋30 s,加入正己烷1 ml,渦旋1 min,在室溫條件下高速離心120 s(12 000×g),取離心后上清液700 μl,吹干,用100 μl甲醇復(fù)溶。色譜條件:采用Waters公司BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);取處理好的溶液5 μl進(jìn)樣,以0.3 ml/min的流速測(cè)定;甲醇-水(96∶4)為流動(dòng)相;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):291 nm。結(jié)果 血漿中維生素E色譜峰分離良好,無(wú)干擾線性回歸方程為:y=118296x+11644,r2= 0.9997,回收率在90%~120%。結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)便,適用于兒童血漿中維生素E含量的快速監(jiān)測(cè)。
[關(guān)鍵詞]維生素E;超高液相色譜法;兒童;血漿
[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721(2018)1(c)-0015-03
UPLC method in the determination of the content of Vitamin E in plasma
1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University in Yunnan Province,Kunming 650032,China;2.Kunming Children′s Hospital in Yunnan Province,Kunming 650034,China
[Abstract]Objective To establish a rapid and accurate method in the determination of the content of Vitamin E in children′s plasma clinically.Methods 200 μl children′s plasma was collected.140 μl methanol and isopropanol were added with the proportion of v/v,8:2,which were vortexed for 30 s.1 ml n-hexane was added and vortexed for 1 min.They were centrifuged at a high speed at room temperature for 120 s (12 000×g).700 μl supernatant was collected after centrifuge,blown dry and redissolved by 100 μl methanol.Chromatographic condition:BEH C18 chromatographic column from Waters company was applied (50 mm×2.1 mm,1.7 μm).The prepared solution of 5 μl was taken as a sample,and determined with the flow rate of 0.3 mL/min.Methanol-water (96:4) was the mobile phase.The column temperature was 30℃.Under the condition,the determination wavelength was 291 nm.Results The chromatographic peak of vitamin E in plasma was separated favorably,and non-interference linear regression equation was y=118296x+11644,r2 = 0.9997.The recovery rate was 90%-120%.Conclusion The method is simple to operate,which is suitable for the rapid determination of Vitamin E content in children′s plasma.
[Key words]Vitamin E;Ultra high liquid chromatography;Children;Plasma
維生素在兒童的正常生長(zhǎng)發(fā)育中必不可少,合理均衡地?cái)z入維生素是兒童體格、智力正常發(fā)展的保證。維生素E發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)20年代,因?yàn)楹腿祟惖慕】迪⑾⑾嚓P(guān),一直受到廣大學(xué)者的關(guān)注,對(duì)其研究也越來(lái)越多。維生素E又稱生育酚(tocopherol)或抗不育維生素,為脂溶性維生素,金黃色或淡黃色黏稠油狀物,易溶于脂肪、乙醇等有機(jī)溶劑,不溶于水,對(duì)熱、酸穩(wěn)定,對(duì)堿不穩(wěn)定,對(duì)氧敏感。維生素E能有效減少皺紋的產(chǎn)生、降低細(xì)胞耗氧量、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化及形成自由基、降低膽固醇、預(yù)防高血壓、防止血液凝固、預(yù)防治療甲狀腺疾病、改善血液循環(huán)、保護(hù)皮膚免受紫外線和污染的傷害、加速傷口愈合等作用[1-4]。同時(shí)研究提示維生素E具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、控制炎癥、基因表達(dá)和認(rèn)知能力的調(diào)控等作用[5-6]。人體自身不能合成維生素E,對(duì)兒童血漿中維生素E的濃度進(jìn)行測(cè)定不僅可以對(duì)兒童營(yíng)養(yǎng)狀況進(jìn)行調(diào)查研究,也可以為臨床上合理補(bǔ)充維生素E提供相關(guān)依據(jù)。維生素 E 的測(cè)定方法有二階導(dǎo)數(shù)光譜法、HPLC法、氣相色譜法等,各種方法各有特點(diǎn)[7-15]。超高液相色譜(UPLC)是以超高速、超高靈敏度、超高分離度為特點(diǎn)的液相色譜。本研究參照高效液相色譜法,改用UPLC法測(cè)定,旨在建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定兒童血漿中維生素E濃度的方法,現(xiàn)報(bào)道如下。endprint
1儀器及試劑
1.1儀器
Waters-ACQUITY-UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),Sar-torius BT125D電子天平(德國(guó)賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),MULTIFUGE X1R超高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司),XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。
1.2試劑
對(duì)照品:維生素E(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):100138-200603);甲醇、乙腈:色譜純(美國(guó)Fisher公司);水:自制超純水,水機(jī)(PURELAB ELGA公司,英國(guó))。
2方法與結(jié)果
2.1色譜條件
采用Waters公司BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);取處理好的溶液5 μl進(jìn)樣(進(jìn)樣量),以0.3 ml/min的流速測(cè)定;甲醇-水(96∶4)為流動(dòng)相;柱溫為30℃;選擇291 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)(維生素E)。
2.2樣品
儲(chǔ)備液的配制:精密稱定維生素E對(duì)照品5 mg,用甲醇稀釋到50 ml量瓶中,充分混勻既得維生素E的儲(chǔ)備液(1000 mg/L)。血樣預(yù)處理:取兒童血漿200 μl,按v/v為8:2的比例加入甲醇和異丙醇140 μl,渦旋30 s,加入正己烷1 ml,渦旋1 min,在室溫條件下高速離心120 s(12 000×g),取離心后上清液700 μl,吹干,用100 μl的甲醇溶液復(fù)溶。
2.3線性關(guān)系
取空白兒童血漿10份(每份200 μl),將不同濃度維生素E 50 μl加入空白血漿中,配成濃度為0.1、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg/ml溶液,按“2.2”操作,按擬定色譜條件以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,作線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=118296x+11644,r2=0.9997,線性范圍為1~60 μg/ml。
2.4空白試驗(yàn)
血漿按照“2.2”的處理方法和上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)維生素E不造成干擾(圖1、圖2)。
2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)
2.5.1儲(chǔ)備液穩(wěn)定性試驗(yàn)
取儲(chǔ)備液分別在1、3、5 d,配制標(biāo)準(zhǔn)使用液4 μg/ml,50 ug/ml直接進(jìn)樣測(cè)定,峰面積RSD為0.7%(4 μg/ml)、2.1%(50 μg/ml),表明儲(chǔ)備液至少在5 d穩(wěn)定。
2.5.2血樣穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一供試品溶液,按上述色譜條件,采用高中低濃度的維生素E標(biāo)本,在0、8、16、24 h進(jìn)行測(cè)定,得到的峰面積RSD分別為2.4%(高濃度組)、2.1%(中濃度組)、1.1%(低濃度組)。結(jié)果提示血漿中的維生素E在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.6重復(fù)性試驗(yàn)
取同一個(gè)批號(hào)的維生素E對(duì)照品精密稱定5 mg,按樣品測(cè)試條件進(jìn)行測(cè)定,求得維生素 E含量的RSD值為1.2%
2.7回收率試驗(yàn)
在標(biāo)本中加入0.5~2倍的維生素E標(biāo)準(zhǔn)品后,按血樣預(yù)處理的方法進(jìn)行處理,按照“2.1”的色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率,回收率在97.2%~110.0%,RSD值為0.63%(表1)。
2.8樣品測(cè)定結(jié)果
本實(shí)驗(yàn)采用UPLC法測(cè)定300例健康兒童血漿中維生素E的含量,測(cè)得濃度范圍為16.31~32.23 μmol/L,平均值為(24.27±7.69) μmol/l。
3討論
維生素E易溶于正己烷而與水溶性成分分離,可達(dá)到提純的作用,本研究中使用少量異丙醇溶解、定容,增大了測(cè)定濃度。選擇吸收波長(zhǎng)291 nm作為測(cè)定波長(zhǎng),靈敏度高,響應(yīng)值強(qiáng),主峰周圍無(wú)其他雜峰干擾,專屬性強(qiáng)。本研究建立了UPLC測(cè)定兒童血漿中維生素E濃度的方法,結(jié)果提示本方法分離效果好、方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、專屬性好,可用于兒童血漿中維生素E含量的測(cè)定,可為臨床補(bǔ)充維生素E提供依據(jù)。維生素 E 有著廣泛的藥物功能,尤其是其優(yōu)良的抗氧化性,在新生兒疾病的預(yù)防和治療方面具有積極作用和重要意義,也是新生兒正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)[16]。王曉燕等[16]總結(jié)了維生素E在兒科中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)維生素E作為體內(nèi)重要的抗氧化劑在治療新生兒缺血性腦病、貧血、新生兒硬腫、新生兒高膽紅素血癥和新生兒尿布皮炎等疾病中都有一定的效果??诜S生素E后經(jīng)過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)人到小腸上皮細(xì)胞, 在人體內(nèi)吸收率存在差異,不同個(gè)體中的吸收率為20%~60% 不等;在這個(gè)過(guò)程中胰腺功能、膽汁酸鹽活性、脂肪的攝入量等因素都會(huì)影響其吸收率。
維生素E在體內(nèi)不能合成,必須從食物中獲得,目前普遍認(rèn)為成人維生素E的日需要量為15~20 mg,過(guò)量使用維生素E會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫能力下降,同時(shí)還會(huì)影響其他維生素的吸收。近年來(lái)對(duì)維生素E的日補(bǔ)充劑量和毒副作用的研究引起了廣大學(xué)者的關(guān)注,梁世秀[17]研究了海參對(duì)維生素E的需要量以及維生素E對(duì)海參非特異免疫的影響,分別用不同劑量的維生素E喂養(yǎng)海參60 d,結(jié)果顯示100 mg/(kg·d)維生素E喂養(yǎng)組生長(zhǎng)速率最快,體內(nèi)超氧化物歧化酶活性最高,因此適量補(bǔ)充維生素E有利于增加機(jī)體的免疫力。對(duì)于兒童維生素E的日補(bǔ)充劑量參照成人標(biāo)準(zhǔn),但是由于兒童特殊的身體結(jié)構(gòu)和生理功能,筆者認(rèn)為維生素E的成人補(bǔ)充劑量不能完全反應(yīng)兒童維生素E的補(bǔ)充劑量,因此,應(yīng)該對(duì)不同年齡階段體內(nèi)維生素E的正常含量做出評(píng)價(jià)。不同年齡階段或者不同個(gè)體維生素E的日補(bǔ)充劑量也是今后的研究方向,特別是對(duì)早產(chǎn)兒和新生兒維生素 E 的治療劑量的研究也亟待解決。
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(收稿日期:2017-10-30 本文編輯:閆 佩)endprint