王勝杰,李成,翁新楚*

(1.上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444;2.上海大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,上海 200444)

可可脂又稱可可白脫,是一種從熱帶木本植物可可樹果實(shí)可可豆中榨出的乳黃色硬性天然植物油脂,屬堅(jiān)果類油脂?？煽芍饕蒷,3-二棕櫚酸-2-油酸甘油酯(POP),1-棕櫚酸2-油酸-3-硬脂酸甘油酯(POSt)和1,3-二硬脂酸-2-油酸甘油酯(StOSt)三種單不飽和甘油三酯組成,三者分別占全部甘油三酯總量的17.5%～22.6%,35.8%～41.4%和22.8%～31.3%[1],這種獨(dú)特的甘油三酯組成方式,使得可可脂的熔點(diǎn)范圍極窄,在34℃～38℃(華氏93℃～100℃)之間,正處于人體體溫附近[2],這種獨(dú)特的熔融特性可以賦予食品美妙的口感,使其廣泛用作高級(jí)糖果巧克力、蛋糕、冰激凌等的原料,市場需求巨大。

隨著人類生活水平的不斷提高與食品工業(yè)的發(fā)展,天然可可脂產(chǎn)量已遠(yuǎn)不能滿足市場需求,目前市場上可可脂的替代品主要分為兩類,代可可脂和類可可脂[3]。類可可脂是指甘油三酯組成與可可脂類似的一類替代油脂,可以與天然可可脂以任意比例混溶,且與代可可脂相比,不存在反式脂肪酸的健康隱患[4],是一種高品質(zhì)的可可脂替代品。

目前市場上的類可可脂主要有兩種獲得途徑,酯交換法和調(diào)配法。調(diào)配法指通過富集飽含POP、POSt和StOSt的各種油脂(棕櫚油、雙羅脂、芒果脂、牛油果脂等)[5],然后以一定的比例進(jìn)行混合,得到類可可脂,由于富含StOSt的油脂本身就稀缺[6],所以該方法具有一定局限性。酯交換法是指通過化學(xué)改性或酶法改性,將富含二位油酸型甘油三酯的植物油(如棕櫚油、烏桕脂、茶油等)進(jìn)行酯交換反應(yīng),通過控制反應(yīng)進(jìn)行程度,使酯交換產(chǎn)物中甘油三酯種類組成和質(zhì)量比例與天然可可脂一致。另外文獻(xiàn)中也出現(xiàn)了利用微生物生產(chǎn)類可可脂的報(bào)道,但是還很不成熟[7]。所有報(bào)道中酶促酯交換法因其原料油來源廣泛,發(fā)展前景廣闊,受到越來越多的關(guān)注與研究[4,7-11]。

本實(shí)驗(yàn)從降低生產(chǎn)成本和可行性出發(fā),利用硬脂酸乙酯為甘油三酯的硬脂酸基供體,在無溶劑體系下通過酶促酯交換反應(yīng)制備類可可脂,整個(gè)過程從酯交換反應(yīng)過程到產(chǎn)物類可可脂的分離都不使用溶劑,具有更高的實(shí)用價(jià)值,另外本研究首次提出利用硬脂酸乙酯作為甘油三酯的硬脂酸基供體。文獻(xiàn)中有關(guān)無溶劑體系制備類可可脂的研究,如Wang[6]，王靈燕等[4,7-11],都是使用硬脂酸甲酯作為甘油三酯的硬脂酸基供體,但Lahimer，Lewis[12-13]等人報(bào)道了硬脂酸甲酯具有誘發(fā)腫瘤的危害性,嚴(yán)禁其應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn),故中國國標(biāo)不允許其作為原料應(yīng)用于食品工業(yè),而本實(shí)驗(yàn)所用原料硬脂酸乙酯(Ethyl Stearate,ESt),是一種被國標(biāo)2760[14]允許的食品添加劑,所以本研究具有更高的應(yīng)用價(jià)值,研究成果可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)主要研究了溫度、底物比、酶添加量等各相關(guān)因素對(duì)酯交換反應(yīng)、類可可脂品質(zhì)的影響,確定了以POMF和硬脂酸乙酯為原料經(jīng)酶促酯交換制類可可脂的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料:棕櫚油中間熔點(diǎn)分提物(POMF),豐益油脂(上海)有限公司贈(zèng)送;硬脂酸、硬脂酸乙酯(ESt)均為分析純,中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;固定化酶Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM,諾維信(中國)有限公司。

試劑:液相用洗脫劑乙腈、二氯甲烷均為色譜純,薄層分析用正己烷、丙酮、乙醚等均為分析純,購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

儀器:HPLC1100高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰科技有限公司);TECHCOMP7890F氣相色譜儀(上海天美科學(xué)儀器公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酯交換反應(yīng)

將一定量的POMF，ESt和硬脂酸加入燒瓶中,添加一定量的固定化脂肪酶,在固定轉(zhuǎn)速的恒溫磁力攪拌器上,一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間得到酯交換產(chǎn)物。

1.2.2 甘油三酯的成分測定

采用高效液相色譜聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)進(jìn)行分析。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱,25 m×4.6 mm,5 μm,流動(dòng)相為乙腈和二氯甲烷(梯度洗脫程序見表1),柱溫20 ℃,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣體積為5 μL。蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)設(shè)置為：漂移管溫度為70 ℃,氮?dú)饬髁?.8 L/min,信號(hào)放大系數(shù)為1,選擇撞擊器“關(guān)”模式[15]。

1.2.3 反應(yīng)產(chǎn)物的分離提純

使用減壓蒸餾法除去ESt和硬脂酸[4,16-17],干法分提除去高熔點(diǎn)甘油三酯。

1.2.4 脂肪酸測定

用電子天平稱取20 mg油樣于10 mL具塞試管中,加入2.5 mL正己烷,再加入1 mL甲醇鈉(0.5 mol/L)溶液,室溫下輕搖5 min,然后加入少量無水硫酸鈉,靜置1 h后于2 000～3 000 r/min下離心2～3 min,上層清液用于氣相色譜分析[18]。

采用氣相色譜聯(lián)用氫離子火焰檢測器(GC-FID)分析脂肪酸組成。色譜柱為Agilent DB-5MS,30 m×0.25 mm,0.50 μm,載氣:氮?dú)?氣化室溫度:250℃,檢測器溫度:260℃,柱溫:180℃(2 min)～240℃(2℃/min)(5 min),進(jìn)樣量:5 μL[19]。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.2.5 評(píng)價(jià)方法

1.2.5.1 目標(biāo)酯交換的得率(Ester exchange rate, E)

以反應(yīng)產(chǎn)物中目標(biāo)甘油三酯(POP、POSt、StOSt)的生成量與原料POMF中 POP、POSt、StOSt的量之比來表示目標(biāo)酯交換反應(yīng)的得率[4,8]。

此公式可以定量反映三種目標(biāo)甘油三酯在反應(yīng)過程中量的變化趨勢,式中:[POP]、[POSt]、[SOSt]分別代表相應(yīng)的甘油三酯酯交換反應(yīng)后質(zhì)量百分含量,[POP]0、[POSt]0、[StOSt]0分別表示相應(yīng)的甘油三酯在原料POMF中的質(zhì)量百分含量。

1.2.5.2 ?；灰瞥潭?Acyl migration degree,A)

?；灰瞥潭?(73.98-反應(yīng)后甘油三酯Sn-2位油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù))/73.98×100%

式中73.98是原料POMF中Sn-2位油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[16-17]。

A值可以定量判斷脂肪酶的1,3位特異性,A值越小,說明脂肪酶特異性越強(qiáng),所得類可可脂品質(zhì)越高。

1.2.5.3 硬脂酸指數(shù)(Stearic acid index,StI)

其中[POP]、[POSt]、[StOSt]分別表示相應(yīng)的甘油三酯的質(zhì)量百分含量,可可脂StI為0.52～0.57, 本研究以StI值達(dá)到0.54為最佳[4, 11, 20]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 酶的種類對(duì)反應(yīng)的影響

工業(yè)化生產(chǎn)的1,3位特異性脂肪酶主要有兩種,Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM。無溶劑體系下硬脂酸甲酯與乙酯相比,其酯交換效率更高,可以使脂肪酶是否具有特異性體現(xiàn)得更充分,因此選用甲酯而非乙酯進(jìn)行脂肪酶在無溶劑體系下的1,3位特異性研究。

在底物質(zhì)量比POMF∶硬脂酸甲酯=1∶1,溫度55℃,轉(zhuǎn)速200 r/min條件下,分別選用固定化酶Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM為催化劑,添加量為底物質(zhì)量10%,反應(yīng)2 h,運(yùn)用HPLC-ELSD檢測連續(xù)檢測反應(yīng)產(chǎn)物中甘油三酯的含量變化,所得液相色譜圖如圖1、圖2所示。

通過圖1,可以清晰地發(fā)現(xiàn)脂肪酶Lipozyme TL IM在無溶劑體系下,其1,3位特異性明顯降低,反應(yīng)過程會(huì)產(chǎn)生較多的高熔點(diǎn)的三飽和甘油三酯,如圖中的PPP、PPSt、PStSt、StStSt等,占總量50%以上,因此不適合在無溶劑體系中作為催化劑制備類可可脂。

Fig.1 Triacylglycerol composition of product determined by HPLC-ELSD analysis when using lipase Lipozyme TL IM圖1 選用脂肪酶Lipozyme TL IM時(shí)所得產(chǎn)物中甘油三酯的液相色譜圖

Fig. 2 Triacylglycerol composition of product determined by HPLC-ELSD analysis when using lipase Lipozyme RM IM圖2 選用脂肪酶Lipozyme RM IM時(shí)所得產(chǎn)物中甘油三酯組成液相色譜圖

通過圖2我們發(fā)現(xiàn),脂肪酶Lipozyme RM IM的 1,3位特異性和選擇性大大提高,產(chǎn)物中高熔點(diǎn)的三飽和甘油三酯,如PPP、PPSt、PStSt等的量占總量5%左右,較Lipozyme TL IM明顯降低,并且副產(chǎn)物甘一脂和甘二脂的量也明顯降低,甘油三酯的組成比例與可可脂相似。

Fig.3 Ester exchange degree and degree of acyl migration versus the substrate specificity圖3 底物比對(duì)反應(yīng)目標(biāo)酯交換得率(E)和?；灰瞥潭茸兓?A)的影響

綜上所述,在無溶劑體系下,脂肪酶Lipozyme RM IM作為酯交換反應(yīng)的催化劑優(yōu)勢明顯,故選擇脂肪酶Lipozyme RM IM為催化劑。

2.2 底物比對(duì)反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度55℃,反應(yīng)時(shí)間為2 h,轉(zhuǎn)速200 r/min,酶用量為10%條件下,設(shè)計(jì)底物硬脂酸乙酯(ESt)與棕櫚油中間分提物(POMF)質(zhì)量比分別為1;2;3;4;5;6;7;8;9,探究底物比對(duì)反應(yīng)過程中?；灰瞥潭?Acyl migration degree,A)和目標(biāo)酯交換的得率(E)的影響,考察結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可知,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量比(硬脂酸乙酯(ESt)/棕櫚油中間分提物(POMF))從1-9時(shí), 目標(biāo)酯交換程度從4.35%增加到33.76%, 在底物比1-6時(shí), 目標(biāo)酯交換程度變化迅速,由4.35%增加到30.87%,但繼續(xù)增加硬脂酸乙酯在底物中含量時(shí),在底物比由6升到9的過程中,目標(biāo)酯交換程度從30.87%增加到33.76%,只增加了2.89%,酯交換程度變化變得較為緩慢。這可能是因?yàn)榈孜锉仍?左右時(shí),體系已經(jīng)趨于平衡,繼續(xù)增加也不會(huì)增加目標(biāo)甘油三酯POSt、StOSt在體系中的含量[8]。

隨著底物比的增加, 酰基位移程度也在輕微變化, 且?；灰瞥潭扰c底物比的增加不是線性增加關(guān)系,隨著底物比的增加,?；灰瞥潭仍黾映潭茸兊迷絹碓矫黠@。如底物比在1-5時(shí),?；灰瞥潭茸兓徛?基本在1.56%左右,但當(dāng)?shù)孜锉仍黾拥?-9時(shí),?；灰瞥潭让黠@增加幅度變快,在底物比為6時(shí)還是1.78%,當(dāng)?shù)孜锉仍黾拥?時(shí),已經(jīng)達(dá)到3.23%。所以說底物比不能盲目增大,增加到一定程度后,?；灰瞥潭葧?huì)迅速增加。這可能是因?yàn)轶w系中硬脂酸乙酯含量增加到一定程度后,酶的定向酯交換能力受到硬脂酸乙酯的脅迫作用,1,3-位定向酯交換能力降低,導(dǎo)致部分甘油三酯中的2-位脂肪酸也被置換。

Fig.4 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the reaction temperature圖4 反應(yīng)溫度對(duì)目標(biāo)酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響

為得到高品質(zhì)類可可脂,酯交換程度越大,?；D(zhuǎn)移程度越小越好。?；D(zhuǎn)移程度增高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生過多的三飽和甘油三酯[21],制成巧克力有蠟感,影響類可可脂的口感;酯交換程度較低時(shí)產(chǎn)生的POSt、StOSt量不足,類可可脂熔點(diǎn)較低,不適合用于制備巧克力。所以綜合可知,具有較高的酯交換程度和較低的?；灰瞥潭鹊拿复脔ソ粨Q產(chǎn)品是研究的目標(biāo)[7], 因此選擇底物比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6作為反應(yīng)底物比較為合適。

2.3 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

在底物質(zhì)量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6∶1,反應(yīng)時(shí)間為2 h,轉(zhuǎn)速200 r/min,酶用量為10%條件下,考察反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物中底物比對(duì)反應(yīng)目標(biāo)酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響,結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出,反應(yīng)溫度從40℃增到55℃,目標(biāo)酯交換程度基本沒有變化,在35%～37%之間。但當(dāng)溫度增至60℃以上時(shí),目標(biāo)甘油三酯POSt、StOSt的酯交換得率E降低明顯,且降低速度隨溫度升高而加快,如在60℃至65℃時(shí),目標(biāo)酯交換得率從35.89%降到34.78%,降低了1.11%,在反應(yīng)溫度從65℃升至70℃時(shí),目標(biāo)酯交換得率從34.78%降到32.57%,降低2.21%。這可能是因?yàn)闇囟冗^高時(shí),酶的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有較大的變化,脂肪酶的1,3-位特異性降低[17],產(chǎn)生較多的非目標(biāo)甘油三酯,如各種三飽和甘油三酯,如PPSt、PStS、StStSt等。所以在反應(yīng)過程中,應(yīng)避免溫度過高。

從三飽和甘油三酯(SSS)含量隨溫度變化趨勢可知,隨溫度升高,三飽和甘油三酯含量增加明顯,且其增加趨勢與目標(biāo)酯交換得率降低趨勢相同,這也在側(cè)面驗(yàn)證了溫度過高會(huì)降低脂肪酶催化劑的1,3-位特異性,使反應(yīng)的特異性降低,產(chǎn)生較多的非目標(biāo)甘油三酯的推論。

綜合以上分析,在較低溫度時(shí)會(huì)得到較高品質(zhì)的類可可脂,但是溫度過低,反應(yīng)速度會(huì)明顯減慢,這不利于酯交換反應(yīng)過程的成本控制,我們應(yīng)該在保證酯交換產(chǎn)物品質(zhì)的前提下盡量升高反應(yīng)溫度,加快反應(yīng)速度。從反應(yīng)溫度對(duì)目標(biāo)酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響趨勢我們可以得出,60℃最適于酯交換反應(yīng)的進(jìn)行。

Fig. 5 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the amounts of enzyme圖5 酶添加量對(duì)目標(biāo)酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響

2.4 酶添加量對(duì)反應(yīng)影響

在底物質(zhì)量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6∶1,反應(yīng)時(shí)間為2 h,轉(zhuǎn)速200 r/min,反應(yīng)溫度60℃條件下,考察酶添加量對(duì)產(chǎn)物中底物比對(duì)反應(yīng)目標(biāo)酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響,設(shè)計(jì)酶添加量分別為底物總質(zhì)量的3%，6%，9%，12%，15%，18%，21%,結(jié)果如圖5。

由圖5可以看出,加酶量低于12%時(shí),目標(biāo)酯交換程度(E)增加的速度與加酶量基本成線性增長關(guān)系,尤其是從3%增加到9%時(shí),成正相關(guān),酶量每增加1%,目標(biāo)酯交換程度增加2.6%,這可能是因?yàn)樵谝欢ǖ拿柑砑恿糠秶鷥?nèi)(酶在反應(yīng)體系中含量較小時(shí)), 加酶量的增加使得反應(yīng)底物與催化劑的接觸機(jī)會(huì)增多, 酯化反應(yīng)速率也增大, 但是由于加酶量的持續(xù)增加,使反應(yīng)體系中酶與底物的接觸量趨于飽和,再增加酶含量對(duì)反應(yīng)速度的增加貢獻(xiàn)減弱[8]。所以在酶含量達(dá)到15%左右時(shí),再增加酶含量到21%過程中,酯交換程度只從30%增加到了33%。

通過飽和甘油三酯含量變化趨勢圖可知,飽和甘油三酯增加速度與酶的添加量成線性關(guān)系,每增加1%的酶,飽和甘油三酯同樣增加約1%,且變化趨勢在討論的酶添加量范圍內(nèi)都適用。因此為保證高品質(zhì)類可可脂的獲得,酶添加量不可以過高。

考慮到酶在反應(yīng)過程中的損耗和成本問題,用量越少經(jīng)濟(jì)效益越高,綜合以上討論,選擇12%作為加酶量較為合適。

2.5 時(shí)間對(duì)反應(yīng)影響

Fig.6 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the time for the reaction圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)目標(biāo)酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響

Fig.7 StI values versus the time for the reaction圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)硬脂酸指數(shù)(StI)的影響

在底物質(zhì)量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6∶1,轉(zhuǎn)速200 r/min,酶添加量12%,反應(yīng)溫度60℃條件下,考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物中目標(biāo)酯交換得率(E)、三飽和甘油三酯(SSS)含量以及硬脂酸指數(shù)(StI)的影響,結(jié)果見圖6、圖7。

由圖6可知,在反應(yīng)前期,前60 min,目標(biāo)酯交換產(chǎn)物的含量增加迅速,目標(biāo)酯交換得率(E)由0增加到了25%左右,這是因?yàn)榉磻?yīng)開始時(shí)底物的濃度較高,反應(yīng)中副反應(yīng)、逆反應(yīng)速度較慢,酶催化酯交換反應(yīng)的速度很快。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,底物濃度下降,產(chǎn)物濃度不斷升高,逆反應(yīng)與副反應(yīng)增多加快,酶催化反應(yīng)速度逐漸減小。110 min后,E值趨于穩(wěn)定,也就是說POP、POSt、StOSt的總含量趨于穩(wěn)定。

由圖7可知,StI值在反應(yīng)開始階段也是增大速度較快,隨著底物的減少,增大速度有所下降并逐漸達(dá)到平衡。在約110 min 時(shí),SI值達(dá)到0.48,POP、POSt、StOSt之間的相對(duì)比例與天然可可脂比較接近,反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)。若反應(yīng)時(shí)間增加,因?yàn)镾tI值不會(huì)繼續(xù)增加,但不定向酯交換會(huì)越來越多,從SSS的含量趨勢看出,飽和甘油三酯含量會(huì)不斷升高,造成類可可脂品質(zhì)降低,不能用作類可可脂。因此,在優(yōu)化條件下,酯交換反應(yīng)的時(shí)間約為110 min。

3 反應(yīng)產(chǎn)物的分離提純

通過減壓蒸餾, 除去產(chǎn)物中的脂肪酸乙酯,干法分提除去高熔點(diǎn)三飽和甘油三酯,得到類可可脂的三種主要甘油三酯POP、POSt、StOSt的含量在74.93%,其含量分別為:POP 32.01%,POSt 34.79%,StOSt 8.15%,與天然可可脂的甘油三酯組成接近, 雖然POP含量較高,StOSt含量較低,但也可以滿足可可脂組成要求,可作為類可可脂大量添加到可可脂中,對(duì)制得巧克力口感不產(chǎn)生明顯影響。

4 結(jié)論

在無溶劑系統(tǒng), 利用1,3-位置特異性固定化脂肪酶催化棕櫚油中間熔點(diǎn)物(POMF)與硬脂酸乙酯進(jìn)行酯交換反應(yīng),經(jīng)過減壓蒸餾和干法分提提純后,可得到與可可脂化學(xué)組成和物理性質(zhì)相似的高品質(zhì)類可可脂。通過對(duì)酶的種類、底物配比、加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間的研究,從降低成本和提高類可可脂品質(zhì)的角度出發(fā),建立了最優(yōu)的工藝條件。其最佳反應(yīng)條件是:選用1,3-位特異性脂肪酶Lipozyme RM IM;反應(yīng)溫度60℃;底物質(zhì)量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6∶1;加酶量為12%(酶/底物,質(zhì)量百分比);反應(yīng)時(shí)間為110 min。

5 致謝

感謝豐益油脂集團(tuán)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的大力支持,感謝侯建平博士對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)與幫助,在此表示感謝!

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