秦浩志， 姜洪波，3， 代 玄， 黃亞迪， 羅曉秋, 張瑞嶺，2△， 杜愛林，2△

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室， 中英腦功能損傷聯(lián)合實驗室， 河南省高校腦研究重點實驗室培育基地, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 河南省生物精神病學(xué)重點實驗室, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院, 河南 新鄉(xiāng) 453003)

研究[1, 2]表明慢性酒精中毒可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損害, 引起學(xué)習(xí)、記憶水平下降和精神行為功能缺陷。在我國，慢性酒精中毒已成為不可忽視的社會公共衛(wèi)生問題, 開發(fā)相關(guān)藥物的意義重大。氨基羥乙酸(aminooxyacetic acid, AOAA)是胱硫醚-β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)活性抑制劑[3]，可抑制內(nèi)原性H2S的生成，進而減少Ca2+內(nèi)流以及細胞內(nèi)Ca2+超載, 從而減少細胞損傷，提高包括ATP酶在內(nèi)的各種酶類的活性，提高5-HT受體蛋白表達，改善受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。

本實驗通過測定AOAA作用于慢性酒精中毒大鼠后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬內(nèi)H2S、線粒體ATP酶活性和5-HT受體蛋白的含量，探究AOAA對慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器與試劑

60只清潔級健康雄性SD大鼠, 體重120～160 g , 由鄭州大學(xué)動物管理中心提供。 Morris水迷宮和行為學(xué)記錄軟件EthoVision XT 8購于德國Noldus公司；高速冷凍離心機購于德國Heraeus公司；Eclipse E200顯微鏡購于日本Nikon公司；超微量總ATP酶測定試劑盒、線粒體提取試劑盒和總蛋白定量測試盒購于中國南京建成生物工程研究所；AOAA購于美國ACROS公司。5-HT受體蛋白抗體、SP試劑盒購于中國博奧森公司；DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純級。

1.2 模型建立

實驗前在22～25℃實驗室中飼養(yǎng)大鼠5～7 d以適應(yīng)實驗室環(huán)境。隨機平均分為空白對照組(Control group)，AOAA治療組(AOAA remedy group)、慢性酒精中毒模型組(Chronic alcoholosis model group), 每組20只。模型組和治療組飲含6%(v/v)酒精水溶液28 d, 每日9：00置換酒精溶液，構(gòu)建酒精中毒大鼠模型[4]。14 d后，按5 mg/kg 比例將AOAA溶解在1 ml生理鹽水中，治療組每日腹腔注射一次，連續(xù)14 d?？瞻讓φ战M及慢性酒精中毒模型組每日腹腔注射1 ml生理鹽水。

1.3 學(xué)習(xí)和記憶能力評價

各組大鼠進行水迷宮測試[5]。Morris水迷宮圓形水池池壁和池底均為黑色，水池四周掛有藍色窗簾以起到遮蔽作用，水池內(nèi)壁高處固定有不同形狀和顏色的實驗用參照物。游泳池等分為四個區(qū)域，代表四個象限，分別標(biāo)記為SW、SE、NW、NE。SE象限中間為水面以下0.5 cm的平臺，平臺可拆卸。定位航行實驗連續(xù)進行4 d，每天上午10點開始進行，每只大鼠每天每個象限訓(xùn)練一次，每天按逆時針方向改變大鼠游泳的開始象限，每次游泳訓(xùn)練的最長記錄時間為60 s。假若大鼠在60 s內(nèi)找到水下平臺，則讓其在平臺上停留30 s，以加強大鼠學(xué)習(xí)記憶；假如大鼠60 s內(nèi)未能找到水下平臺，則用工具將其引導(dǎo)至水下平臺停留30 s。在定位航行試驗中，攝像裝置記錄大鼠的游泳軌跡，行為學(xué)記錄軟件EthoVision XT 8測量每只大鼠每天每次到達逃生平臺的時間(潛伏期)和路徑長度(游泳距離), 潛伏期和游泳距離越短，說明大鼠學(xué)習(xí)能力越強?？臻g探索實驗在定位航行實驗結(jié)束之后進行，以測量大鼠空間位置記憶的保持能力，只進行一天。此次實驗與定位航行實驗的差別在于將水面高度調(diào)節(jié)到預(yù)定高度后移除水下平臺；大鼠在目標(biāo)象限的對側(cè)釋放；大鼠的游泳時間延長為300 s，攝像裝置記錄大鼠的游泳軌跡，并制成軌跡圖像。在空間探索實驗軌跡圖像中，穿越平臺次數(shù)越多，平臺所在象限游泳距離比重越大說明大鼠學(xué)習(xí)能力越強。

1.4 分光光度法間接測定海馬組織H2S的含量

學(xué)習(xí)和記憶能力評價實驗結(jié)束后，腹腔麻醉大鼠, 斷頭取腦, 分離海馬新鮮組織，立即放入-80℃冰箱保存，在低溫環(huán)境下制成組織液。采用亞甲基藍分光光度法[6]，使用分光光度計測大鼠海馬組織液在波長670 nm處的吸光度，按照H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計算海馬組織H2S含量。

1.5 海馬線粒體提取

按照線粒體提取試劑盒說明書從凍存海馬組織中獲得線粒體。

1.6 總蛋白濃度測定

按照總蛋白定量測試盒說明書，利用酶標(biāo)儀測試液體樣品和海馬組織樣本吸光值，計算海馬組織總蛋白濃度。

1.7 線粒體ATP酶活力的測定

按照超微量總ATP酶測定試劑盒說明書，依次經(jīng)過組織前處理、酶促反應(yīng)和定磷，測定在波長636 nm處的吸光度，計算出ATP酶的活性。

1.8 免疫組化觀察5-HT受體

每組隨機選取4只大鼠進行取腦、固定、石蠟包埋、切片。切片經(jīng)過脫蠟、修復(fù)、免疫組化后在暗處進行DAB顯色，顯色完成后進行脫水、透明、中性樹膠封片，之后用顯微鏡觀察雙側(cè)海馬并拍攝圖片，并用image-pro-plus 6.0 圖像分析軟件分析蛋白的陽性表達情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績

如表1，2所示，定位航行實驗期間，與空白對照組大鼠相比，慢性酒精中毒模型組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯降低, 表現(xiàn)為潛伏期和游泳距離的增多，第2至4日有極顯著性差異(P<0.01)；給予AOAA干預(yù)后，與模型組相比，治療組大鼠潛伏期和游泳距離明顯減少, 第2至4日有極顯著性差異(P< 0.01)。

水迷宮第5日實驗空間探索實驗大鼠代表性軌跡, 如圖1，在水迷宮第5日實驗空間探索實驗中，與空白對照組相比，模型組大鼠軌跡在各象限分布明顯均勻，平臺穿越次數(shù)明顯減少，給予AOAA干預(yù)后，與模型組相比，治療組大鼠軌跡明顯集中在平臺所在象限，且平臺穿越次數(shù)明顯增多。

GroupDay1Day2Day3Day4Control51.94±14.7930.13±16.7925.13±14.9317.03±9.13Model56.13±12.6049.38±17.72??39.38±20.97??29.06±15.86??AOAA54.50±13.1336.69±16.88?? ##34.09±16.30## 19.69±12.56##

Model： Chronic alcoholism model group； AOAA： Aminooxyacetic acid remedy group

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAOAA remedy group

GroupDay1Day2Day3Day4Control939.52±106.46714.74±117.54435.64±72.30230.55±23.78 Model1020.93±119.82898.33±147.45??680.44±99.66??454.00±98.07??AOAA954.06±132.03759.55±153.94##473.08±72.41##239.85±31.49##

Model： Chronic alcoholism model group； AOAA： Aminooxyacetic acid remedy group

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAOAA remedy group

Fig.1Exploratory trajectory of rats in each group in spatial probe test

A: Control group; B: Chronic alcoholism model group; C: AOAA remedy group

2.2 海馬組織中H2S和線粒體ATP酶活性的含量變化

如表3所示，與空白對照組相比，模型組大鼠海馬組織內(nèi)的H2S含量明顯增高，有極顯著性差異(P<0.01)；給予AOAA干預(yù)后，與模型組大鼠相比，治療組大鼠海馬組織中H2S含量降低，有極顯著性差異(P<0.01)。

與空白對照組相比，模型組大鼠海馬組織內(nèi)的線粒體ATP酶活性明顯降低，有極顯著性差異(P<0.01)；給予AOAA干預(yù)后，與模型組大鼠相比，治療組大鼠海馬組織內(nèi)線粒體ATP酶活性上升，有極顯著性差異(P<0.01)。

GroupH2S level(nmol/g)Mitochondrial ATPase activity(μmolPi/mg prot hour)Control35.47±2.481.98±0.04Model57.44±3.04??1.49±0.05??AOAA42.88±3.27??##1.75±0.11??##

Model： Chronic alcoholism model group； AOAA： Aminooxyacetic acid remedy group

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAOAA remedy group

2.3 光鏡觀察海馬組織CA1、CA3區(qū)5-HT受體蛋白表達

5-HT受體蛋白定位于細胞膜部位，陽性細胞顯示棕黃色。對海馬組織CA1、CA3區(qū)免疫組化染色陽性細胞平均光密度值進行分析。并將CA1、CA3區(qū)陽性結(jié)果表達情況進行比較。

如圖 2，圖3所示，各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)均可見一定量5-HT受體陽性表達，陽性反應(yīng)細胞著色呈深棕黃色(圖2，3見彩圖頁Ⅰ)。如表4所示，與空白對照組相比，其余兩組5-HT受體陽性表達量明顯降低，差異有極顯著性(P<0.01)，其中以模型組降低最為明顯。治療組與模型組比較，5-HT受體陽性表達明顯升高，有極顯著差異性(P< 0.01)。

GroupAOD in hippocampus CA1AOD in hippocampus CA3Control0.14±0.010.15±0.01Model0.12±0.01??0.12±0.01??AOAA0.13±0.01??##0.14±0.01??##

AOD： Average optical density； Model： Chronic alcoholism model group； AOAA： Aminooxyacetic acid remedy group

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAOAA remedy group

3 討論

慢性酒精中毒是一種對人神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷的進行性疾病，不僅嚴(yán)重損害患者的身體健康，而且極易引發(fā)社會問題。目前認(rèn)為酒精中毒可能是涉及多種受體作用的復(fù)雜機制。H2S是人體內(nèi)重要的氣體信號分子。含硫氨基酸在體內(nèi)分解代謝可生成半胱氨酸，半胱氨酸受CBS催化生成H2S[7]。H2S能夠快速通過細胞膜，對許多生物靶點造成影響，兼具細胞保護和細胞毒性作用[8]。高濃度H2S的細胞毒性表現(xiàn)為兩方面：一方面增強由N-甲基-D-天冬氨酸受體介導(dǎo)的鈣超載，對線粒體能量代謝造成傷害，進而導(dǎo)致細胞損傷[4，9，10]；另一方面通過對興奮性突觸后膜電位特異性的抑制，阻礙突觸傳遞，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能起到抑制作用[11, 12]。有研究顯示，慢性酒精中毒能夠激活CBS, 催化H2S的大量形成[13]。

ATP是組織細胞生命活動所需能量的直接來源。ATP酶催化ADP氧化磷酸化成ATP，對機體的正常運轉(zhuǎn)具有十分重要的作用。ATP酶活性在細胞損傷狀態(tài)下發(fā)生改變[14]。

5-HT在神經(jīng)中樞中廣泛存在，可參與對情感、睡眠、學(xué)習(xí)、體溫和記憶等多種生理功能的調(diào)節(jié)[15，16]。有研究表明，中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)與酒精成癮密切相關(guān)，5-HT系統(tǒng)一方面可以通過抑制中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)來緩解酒精中毒癥狀, 另一方面可以明顯減弱谷氨酸誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)向電流，提高神經(jīng)細胞的存活率。有研究顯示，長期攝入乙醇可以抑制五羥色胺的表達，使5-HT 能神經(jīng)體系功能活動減弱[17]。三突觸環(huán)路是繼Papez環(huán)路之后人類發(fā)現(xiàn)的又一記憶回路。內(nèi)嗅皮層發(fā)出穿通纖維與齒狀回顆粒細胞產(chǎn)生突觸聯(lián)系，隨后齒狀回顆粒細胞經(jīng)過苔狀纖維與海馬CA3區(qū)神經(jīng)元生成突觸聯(lián)系，CA3區(qū)再通過Schaffer側(cè)支與CA1區(qū)產(chǎn)生突觸聯(lián)系[18]。

AOAA是CBS活性抑制劑[3]，可以通過抑制CBS活性來減少H2S的生成，抑制細胞損傷。為了探究AOAA對慢性酒精中毒大鼠的腦保護作用，本研究檢測了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、海馬H2S含量、線粒體ATP酶活性和CA1、CA3區(qū)5-HT受體的蛋白表達。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降, H2S含量升高，線粒體ATP酶活性降低, 5-HT受體蛋白含量下降，差異極具顯著性(P<0.01)；與模型組比較，AOAA治療組學(xué)習(xí)記憶能力有所提高, H2S含量降低，線粒體ATP酶活性升高, 5-HT受體蛋白的表達有所增加，差異極具顯著性(P<0.01)。

由此提示，AOAA改善慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用途徑可能是AOAA通過抑制CBS活性，減少體內(nèi)H2S生成，從而減輕細胞內(nèi)鈣超載，進而改善受鈣超載損害的線粒體能量代謝，能量代謝的改善使得5-HT受體蛋白的表達改善，最終使得海馬三突觸循環(huán)通路得到改善，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力隨之提高。該AOAA作用途徑的提出可為慢性酒精中毒的治療提供新的思路。但由于本實驗只對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬組織硫化氫含量、線粒體ATP酶活性以及5-HT受體蛋白的含量進行檢測，因此，要想為慢性酒精中毒的損傷機制和AOAA對其治療提供更加科學(xué)的依據(jù)，還需更進一步的研究。