張 勇, 李苗苗, 華田苗, 孫慶艷

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 蕪湖 241000)

肝臟是一種重要的器官，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的糖代謝、蛋白質(zhì)代謝和脂肪代謝，其損傷會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。酒精濫用會(huì)改變自身免疫調(diào)節(jié)并導(dǎo)致免疫缺陷，長期大量飲酒會(huì)引起全身各臟器的代謝和功能異常，更可能引起一系列的肝損傷，其中包括肝臟脂肪變性、肝纖維化、肝硬化和再生功能減弱等一系列的酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)[1, 2]。茶多酚是一種復(fù)合物，具有多種有益的作用。有研究發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)大鼠酒精性肝病有抗氧化與抗纖維化的作用[3]，但是關(guān)于茶多酚對(duì)慢性酒精中毒肝損傷的具體保護(hù)機(jī)制尚不明確。本研究建立了慢性酒精誘導(dǎo)的成年大鼠肝損傷動(dòng)物模型，并進(jìn)行茶多酚的干預(yù)，以脂體比衡量?jī)?nèi)臟脂肪含量，以肝指數(shù)和油紅O染色結(jié)果衡量肝臟的脂質(zhì)沉積，以超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)活力與丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的比值、總抗氧化能力(total antioxidant capacity assay, T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活力等氧化應(yīng)激指標(biāo)來衡量肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)，檢測(cè)大鼠肝組織中脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase, FAT/CD36)蛋白表達(dá)情況，觀察茶多酚的干預(yù)對(duì)慢性酒精誘導(dǎo)的肝損傷大鼠的防護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康7周齡 SD 雄性大鼠36 只，體重180～220 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[scxk[浙]2014-0001]。動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，環(huán)境相對(duì)濕度(55.4±3.0)%，溫度(24±2)C，明暗周期12 h：12 h。

1.2 慢性酒精中毒大鼠模型的建立及茶多酚干預(yù)

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control, CON)、酒精損傷組(Ethanol, ETH)和茶多酚干預(yù)組(Tea polyphenols intervention, TPI)，每組 12 只，分籠飼養(yǎng)，均在相同環(huán)境下自由攝食和飲水。對(duì)照組用0.9%生理鹽水按 7 g/kg 灌胃；酒精組用體積分?jǐn)?shù)56%的紅星牌酒精(北京紅星)同劑量灌胃；茶多酚組在酒精灌胃同時(shí)按照0.25 g/kg劑量灌胃給予茶多酚(上海伊卡)[4]。每天上午 9：00定時(shí)進(jìn)行灌胃，1 次/天，持續(xù) 8 周。

1.3 樣本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有動(dòng)物禁食12 h, 保持自由飲水。大鼠稱重后，以10%的水合氯醛按0.3 ml/100 g劑量麻醉大鼠，每組隨機(jī)選取5只，直接打開腹腔，取腎周脂肪墊和附睪脂肪墊，稱脂肪濕重，將兩者重量之和作為內(nèi)臟脂肪重量，并計(jì)算腎周脂肪和附睪脂肪重量占體重的百分比即脂體比。取肝臟，稱肝臟濕重，計(jì)算肝臟重量占體重的百分比即肝指數(shù)。將肝臟液氮速凍， -80℃存儲(chǔ)備用。

每組其它剩余大鼠(CON，n=7; ETH,n=5; TPI,n=6)打開胸腔，找到心臟，剪開心包膜，剪開左心室，將灌流針插入至主動(dòng)脈，用止血鉗結(jié)扎住剪開口，打開生理鹽水灌注，剪開右心耳，灌注8 min，至肝臟發(fā)白后灌注 4% 多聚甲醛進(jìn)行預(yù)固定，灌注至大鼠身體僵硬后取肝臟，并移入 4% 多聚甲醛固定液中固定至組織沉底，4℃儲(chǔ)存待制作組織切片。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

取固定肝臟組織做冰凍切片，進(jìn)行油紅O染色。染色后的切片在OlympusBX-51顯微鏡下觀察，用Image-Pro Express6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集，對(duì)油紅O染色的肝臟脂質(zhì)沉積進(jìn)行積分光密度分析。取大鼠肝臟組織制備勻漿液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，采用超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)，丙二醛(malondialdehyde, MDA)，總抗氧化能力(total antioxidant capacity assay, T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒(南京建成)分別測(cè)定肝臟中SOD活力，MDA含量，T-AOC能力和GSH-Px活力；采用FAT/CD39免疫組化試劑盒(北京博奧森)和ELISA試劑盒(武漢博士德)對(duì)FAT/CD36在肝組織中表達(dá)情況進(jìn)行定位和定量檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀況

8 周的干預(yù)結(jié)束后，酒精組死亡 2 只，茶多酚組死亡 1 只，對(duì)照組全部存活。死亡大鼠解剖結(jié)果顯示肺出血，氣管分泌物增多，分析主要原因由于灌胃時(shí)酒精誤嗆入肺導(dǎo)致。其它存活大鼠每天灌胃結(jié)束后觀察活動(dòng)狀態(tài)和生命特征，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠灌胃后活動(dòng)能力良好，意識(shí)清楚，正常攝食，酒精組和茶多酚組大鼠每次灌胃后逐漸昏迷，呈昏睡狀態(tài)，攝食和運(yùn)動(dòng)減少。2 h持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，酒精組和茶多酚組大鼠逐漸恢復(fù)正?；顒?dòng)和攝食，并且茶多酚組大鼠恢復(fù)清醒時(shí)間較酒精組短。

2.2 茶多酚干預(yù)后大鼠體重，脂體比，大鼠肝指數(shù)和脂質(zhì)沉積變化

8 周喂養(yǎng)后，三組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酒精組脂體比顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，茶多酚組脂體比顯著高于酒精組(P<0.05, 表1)。

酒精組肝指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，茶多酚組肝指數(shù)顯著低于酒精組(P<0.01)。肝臟油紅O染色結(jié)果可見，肝臟細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，肝臟細(xì)胞中的脂滴被染成紅色。對(duì)照組肝臟細(xì)胞染色淺淡，酒精組與對(duì)照組相比，肝細(xì)胞內(nèi)含大量染成紅色的脂滴沉積。茶多酚組與酒精組相比，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積減少 (圖1，表1)。

Fig.1Results of Oil Red O staining (×400)

A： Control group； B： Ethanol group； C： Tea polyphenols intervention group

Tab. 1 Effects of tea polyphenols intervention(TPI)on body weight, visceral fat weight/body weight ratio, liver index, hepatic lipid deposition and FAT/C36

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsethanol group

2.3 茶多酚干預(yù)后大鼠肝臟中SOD/MDA、T-AOC和GSH-Px活性變化

酒精組中SOD/MDA、T-AOC和GSH-Px活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。茶多酚組SOD/MDA顯著高于酒精組(P<0.01)。茶多酚組T-AOC和GSH-Px活性顯著高于酒精組(P<0.05，表2)。

GroupSOD/MDA(U/nmol)T-AOC(U/mg prot)GSH-Px(U/mg prot)Control0.0200±0.003320.18±1.2120.88±0.95Ethanol0.0110±0.0012?? 14.54±1.07??10.50±1.03??TPI0.0170±0.0014##16.85±1.32#16.70±0.93#

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsethanol group

2.4 茶多酚干預(yù)后大鼠肝臟中FAT/CD36免疫組織化學(xué)染色及ELISA分析結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見，三組肝臟切片中均有FAT/CD36免疫陽性細(xì)胞分布，免疫陽性物質(zhì)集中在細(xì)胞膜上，呈棕黃色或者棕褐色。酒精組FAT/CD36免疫陽性細(xì)胞積分光密度顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，茶多酚干預(yù)組顯著低于酒精組(P<0.05，圖2，表1)。

ELISA測(cè)定結(jié)果顯示酒精組大鼠肝臟中FAT/CD36蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，茶多酚組顯著低于酒精組(P<0.01，圖3)。

Fig.2The results of FAT/CD36 immunohistochemistry

A： Control group； B： Ethanol group； C： Tea polyphenols intervention group；： Fos-like immunoreactivity

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsethanol group

3 討論

肝臟作為機(jī)體以代謝功能為主的重要器官，在機(jī)體內(nèi)起到去氧化，儲(chǔ)存肝糖原和分泌蛋白等主要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)長期大量攝入酒精會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，氧自由基增加，肝臟脂質(zhì)異常積累，從而引起肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞壞死，肝硬化等一系列病理反應(yīng)[5]。研究表明，茶多酚是一種多組分復(fù)合物，能夠清除機(jī)體氧自由基[6]，對(duì)大鼠酒精性肝病有抗纖維化的作用[7, 8]。

動(dòng)物和臨床研究發(fā)現(xiàn)酒精攝入會(huì)減少嚙齒動(dòng)物的內(nèi)臟脂肪含量，同時(shí)也會(huì)提高肝臟攝入的脂肪量[9-11]，表明白色脂肪組織(white adipose tissue, WAT)脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)在肝臟脂質(zhì)沉積中起重要作用[12]。當(dāng)白色脂肪組織的脂質(zhì)貯存出現(xiàn)紊亂，會(huì)導(dǎo)致過多的游離脂肪酸流入肝臟，引起肝臟脂質(zhì)沉積。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) 8 周的茶多酚干預(yù)結(jié)束時(shí)，酒精組脂體比顯著小于對(duì)照組，茶多酚干預(yù)組顯著高于酒精組；酒精組肝指數(shù)顯著大于對(duì)照組，茶多酚干預(yù)組顯著低于酒精組，同時(shí)油紅 O 染色結(jié)果顯示酒精組肝臟細(xì)胞中脂滴較對(duì)照組增加，茶多酚干預(yù)組較酒精組減少。這些結(jié)果說明 8 周的酒精攝入引起大鼠內(nèi)臟脂肪減少，肝臟脂質(zhì)沉積增加，這與過去的研究一致，而茶多酚干預(yù)引起內(nèi)臟脂肪含量增加，同時(shí)伴隨著肝臟脂質(zhì)沉積減少。這可能是由于茶多酚干預(yù)減弱脂肪組織中脂肪水解酶對(duì)脂肪的分解作用，從而減少流入肝臟的脂肪酸。

FAT/CD36是一種跨膜糖蛋白，在體內(nèi)分布廣泛，能夠參與脂質(zhì)的代謝，是肝臟攝取游離脂肪酸的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體[13, 14]。過去的研究發(fā)現(xiàn)，減弱 FAT/CD36 介導(dǎo)的脂肪酸攝取，將可以避免肝細(xì)胞脂毒性的發(fā)生[15]。通過藥理學(xué)手段或 cDNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)肝臟 FAT/CD36 的過量表達(dá)，將會(huì)引起脂肪肝的發(fā)生，進(jìn)一步會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)代謝紊亂[16]。Zhong W 等發(fā)現(xiàn) 8 周的酒精攝入會(huì)引起小鼠肝臟中甘油三酯和膽固醇積累增加，并檢測(cè)到 FAT/CD36 在 mRNA 和蛋白水平表達(dá)的增加[17]。本研究通過免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酒精組大鼠肝臟 FAT/CD36 蛋白表達(dá)量顯著大于對(duì)照組，茶多酚干預(yù)組顯著小于酒精組。說明 8 周的茶多酚干預(yù)能引起肝細(xì)胞膜上 FAT/CD36 蛋白表達(dá)量減少，從而減少肝臟對(duì)游離脂肪酸的攝入量。

發(fā)生肝臟脂質(zhì)沉積時(shí)，大量脂滴占據(jù)細(xì)胞質(zhì)的空間，將會(huì)影響肝細(xì)胞的正常功能，使其容易受到毒性物質(zhì)和應(yīng)激因素的作用。超氧化物歧化酶(SOD)是一種在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)的活性物質(zhì)，能夠清除機(jī)體氧自由基，組織內(nèi)丙二醛(MDA)含量直接反應(yīng)脂質(zhì)過氧化的速率和強(qiáng)度?？偪寡趸芰?T-AOC)是整體衡量機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)。谷胱甘肽過氧化物酶(GHS-Px)是一種重要的分解過氧化物的催化酶。本研究以 SOD/MDA、T-AOC 和 GSH-Px 來較全面地衡量機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn) 8 周的酒精攝入使酒精組肝臟中 SOD/MDA、T-AOC 和 GSH-Px活性均顯著小于對(duì)照組，說明酒精使大鼠肝臟出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，這一結(jié)果與過去的研究發(fā)現(xiàn)一致[18]。茶多酚干預(yù)使大鼠肝臟 SOD/MDA，T-AOC 和 GSH-Px 活性顯著大于酒精組，說明茶多酚干預(yù)能夠緩解酒精攝入引起的大鼠肝臟中的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

綜上所述，茶多酚干預(yù)能夠減少慢性酒精中毒大鼠內(nèi)臟脂肪的分解，從而減少隨血液循環(huán)系統(tǒng)流向肝臟的脂肪酸，同時(shí)肝細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)脂肪酸攝入的 FAT/CD36 含量降低，減少肝細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取，從而減少脂質(zhì)在肝臟的積累。同時(shí)，茶多酚干預(yù)還能夠緩解肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而減輕肝損傷。

肝細(xì)胞除了通過 FAT/CD36 攝取游離脂肪酸以外，還可以通過脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1 (fatty acid transport protein-1, FATP-1)和肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白 (fatty acid binding protein, L-FABP) 等轉(zhuǎn)運(yùn)體來進(jìn)行游離脂肪酸的攝取[19]。茶多酚對(duì) FAT/CD36的表達(dá)有干預(yù)效應(yīng)，是否對(duì) FATP-1 和 L-FABP 同樣具有干預(yù)效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。