賈 強， 王 蕾， 王其一， 劉小粉， 馬善峰， 楊 銳

(蚌埠醫(yī)學院生理學教研室， 安徽 蚌埠 233030)

糖尿病腎病是糖尿病嚴重的慢性并發(fā)癥之一，其由糖尿病微血管病變引起，最終導致慢性腎功能衰竭[1]。腎臟纖維化是糖尿病腎病重要的病理改變之一。腎臟纖維化的特征主要表現(xiàn)在肌成纖維細胞數(shù)量增加，炎性細胞浸潤、聚集，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分如膠原蛋白和纖維連接蛋白等過度積聚[2, 3]。研究發(fā)現(xiàn)，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad3信號通路在腎臟纖維化中起重要作用[4]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是體內發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子[5]。內源性H2S主要由胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)分解L-半胱氨酸產(chǎn)生。CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)；CSE則主要存在于心血管系統(tǒng)，且容易被炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PAG)阻斷[6]。大量研究表明，H2S對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和視覺系統(tǒng)等均發(fā)揮重要的生理調節(jié)功能[7-9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)CSE/H2S與腎臟纖維化密切相關[10]，但其具體作用機制尚不清楚。因此，本研究通過建立1型糖尿病大鼠腎損傷模型，分別給予H2S的外源性供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)和CSE的阻斷劑PAG干預，觀察H2S對糖尿病大鼠腎臟纖維化的影響并探討其分子作用機制，旨在為H2S在臨床上治療糖尿病腎病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠(32只)由蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心提供，體質量(180±20) g。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、NaHS和PAG購自Sigma公司；血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)和羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素6 (interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技公司；兔抗大鼠Smad3和磷酸化Smad3(phosphorylated-Smad3，p-Smad3)一抗抗體購自Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗抗體購自Abcam公司；兔抗大鼠IV型膠原(collagen-IV，col-IV)一抗抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗抗體購自武漢博士德公司。

1.2 動物分組及模型建立

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照(NC)組、糖尿病對照(DC)組、糖尿病+NaHS(DM+NaHS)組和糖尿病+PAG(DM+PAG)組(n=8)。大鼠禁食12 h后，NC組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，其余3組大鼠均一次性腹腔注射55 mg/kg STZ。3 d后，大鼠禁食后測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，取FBG≥16.7 mmol/L為1型糖尿病大鼠。造模成功后，所有大鼠自由飲食、飲水。第5周起，NC組和DC組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，DM+NaHS組和DM+PAG組大鼠分別腹腔注射56 μmol/kg NaHS和40 mg/kg PAG[6]，每天1次，共干預4周。

1.3 檢測FBG、BUN和SCr水平

第8周末，大鼠腹腔注射4%水合氯醛(10 ml/kg)誘導麻醉，測FBG值。腹主動脈采血取血清，利用試劑盒檢測血清中BUN和SCr水平。

1.4 Masson染色觀察腎膠原纖維沉積

取大鼠新鮮腎臟，浸于10%福爾馬林中固定，脫水、包埋、切片，Masson染色后觀察膠原纖維變化。應用Image-Pro Plus 6.0軟件，每張切片隨機選取5個不同視野，測定膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF=膠原面積/總面積，取平均值。

1.5 電鏡觀察腎皮質超微結構變化

取大鼠新鮮腎組織，切割成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，浸入4℃、2.5%戊二醛溶液中固定，脫水包埋、制備超薄切片。經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射電鏡觀察腎皮質超微結構變化。

1.6 腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平檢測

取大鼠腎臟，冰上制備組織勻漿，分別按照試劑盒說明書操作，檢測IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平。

1.7 Western blot檢測腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3和col-IV蛋白水平

提大鼠腎臟組織蛋白，測蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉印至PVDF膜上。室溫封閉2 h，再分別加入1∶1 000稀釋的TGF-β1、Smad3和p-Smad3一抗抗體，1∶300稀釋的col-IV一抗抗體，1∶2 000稀釋的GAPDH一抗抗體，4℃過夜孵育；TBST緩沖液洗膜后，加入1∶2 000稀釋的二抗抗體，室溫孵育1 h；增強化學發(fā)光法顯影，曝光成像后測定條帶的灰度值，計算各目的蛋白的相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組FBG、BUN和SCr水平的變化

與NC組比較，DC組大鼠的FBG、BUN和SCr值顯著增大(P<0.01)。與DC組比較，DM+NaHS組和DM+PAG組FBG均無顯著性差異，DM+NaHS組大鼠的BUN和SCr值顯著減小(P<0.01)；DM+PAG組BUN和SCr值較DC組進一步增加(P< 0.01，表1)。

GroupFBG (mmol/L)BUN (mmol/L)SCr (μmol/L)NC5.75±0.867.15±0.7226.34±2.57DC24.96±3.62??14.85±1.60??43.60±3.24??DM+NaHS22.48±3.4511.69±1.23##35.28±3.01##DM+PAG25.83±3.7117.10±1.74##48.52±2.76##

FBG: Fasting blood glucose; BUN: Blood urea nitrogen; SCr: Serum creatinine

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

2.2 各組腎臟膠原纖維和CVF的變化

Masson染色結果(圖1)顯示：NC組大鼠腎小球和腎小管正常，膠原沉積較少；DC組腎小球和腎小管膠原沉積明顯增多。與DC組相比，DM+NaHS組腎小球和腎小管膠原纖維沉積明顯減少；DM+PAG組膠原纖維沉積明顯增加。

膠原纖維分析結果顯示，與NC組相比，DC組膠原容積分數(shù)(CVF)從9.56±1.45上升至23.31±3.18(P<0.01)。與DC組相比，DM+NaHS組CVF下降至16.20±2.59(P<0.01)；DM+PAG組CVF上升為27.43±3.62(P<0.01)。

Fig.1The deposition of collagen fibers in rat renal tissues (Masson staining ×400)

A: Normal control group(NC); B: Diabetic control group(DC); C: Diabetes mellitus(DM)+ Sodium hydrosulfide(NaHS)group; D: DM+DL-propargylglycine(PAG)group

2.3 各組腎皮質超微結構的變化

透射電鏡結果顯示，NC組中腎小球基底膜厚度均一，足細胞的足突形狀正常、排列整齊。DC組腎皮質基底膜明顯增厚，系膜基質增多，多個足突融合。DM+NaHS組腎小球基底膜厚度明顯改善，系膜基質增生減少，足突融合程度較DC組明顯減輕。DM+PAG組較DC組損傷進一步加重，基底膜增厚顯著、系膜基質增多，足突融合(圖2)。

Fig.2Changes of ultrastructure in the different groups(×20 000)

A: Normal control group(NC); B: Diabetic control group(DC); C: Diabetes mellitus(DM)+ Sodium hydrosulfide(NaHS)group; D: DM+DL-propargylglycine(PAG)group

2.4 各組腎臟組織IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平的變化

與NC組比較，DC組腎臟組織IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平顯著增高(P<0.01)。與DC組比較，DM+NaHS組IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平明顯降低(P<0.01)；DM+PAG組IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平較DC組進一步增高(P<0.01，表2)。

GroupIL-1β (pg/mg)IL-6 (pg/mg)TNF-α (pg/mg)Hyp (μg/mg)NC29.73±3.4549.25±4.83109.24±11.783.09±0.44DC60.58±5.21??87.32±6.84??201.69±20.15??6.07±0.72??DM+NaHS47.26±4.67##73.81±6.37##163.52±18.76##4.85±0.68##DM+PAG68.30±5.09##96.63±6.92##227.55±21.60##7.16±0.75##

IL-1β: Interleukin-1β; IL-6: Interleukin-6; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; Hyp: Hydroxyproline

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

2.5 各組腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3和col-IV蛋白表達水平的變化

與NC組比較，DC組腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平顯著增高(P<0.01)。與DC組比較，DM+NaHS組腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平顯著降低(P<0.01)；DM+PAG組腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平較DC組進一步增高(P<0.01，表3，圖3)。

Tab.3 Protein expression levels of TGF-β1, Smad3, p-Smad3 and col-IV in rat renal tissues n=8)

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; col-IV: Collagen-IV; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

Fig.3The expressions of TGF-β1, Smad3, p-Smad3, col-IV and GAPDH in rat renal tissues tested by Western blot

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; col-IV: Collagen-IV; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

3 討論

糖尿病是由于機體胰島素分泌相對或絕對不足，出現(xiàn)以持續(xù)高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征。糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一，也是導致慢性腎功能衰竭和終末期腎病的主要原因。糖尿病腎病的主要病理改變是炎細胞浸潤，腎小球系膜基質增加，基底膜增厚和間質纖維化[11]。腎臟纖維化是以ECM如col-IV過度積累、異常沉積為特征，最終導致腎小球硬化、腎功能衰竭[12]。Masson染色是常用的檢測膠原纖維沉積的方法。此外，Hyp是合成col-IV的主要原料。本實驗結果顯示，與NC組大鼠比較，DC組大鼠的FBG、BUN和SCr水平顯著增加，腎超微結構損傷明顯加重，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表達顯著增加，表明糖尿病會引發(fā)腎臟損傷及腎組織纖維化。

H2S是繼一氧化氮和一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的第3種內源性氣體信號分子，參與體內多個組織系統(tǒng)的生理功能調控[13]。最近的研究表明，外源性H2S具有減輕糖尿病腎臟纖維化的作用[14]，但是其具體機制目前尚不清楚。本實驗中，給予外源性H2S的供體NaHS治療后，雖然H2S對FBG的影響較小，但DM+NaHS組大鼠BUN和SCr水平較DC組明顯降低，腎超微結構損傷明顯改善，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表達明顯降低；而給予CSE的阻斷劑PAG干預后，DM+PAG組大鼠BUN和SCr水平增高，腎超微結構損傷加重，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表達較DC組均進一步提高，提示H2S在調節(jié)糖尿病大鼠腎臟損傷和纖維化過程中發(fā)揮重要的作用，且外源性H2S可明顯減輕糖尿病腎臟纖維化。

TGF-β1是腎臟中所有類型的細胞均能夠合成的一種促纖維化介質。在纖維化疾病中，促炎因子TNF-α可誘導TGF-β1表達上調[15]。在糖尿病大鼠腎臟中，TGF-β1表達明顯增高[16]。TGF-β1還可激活ECM基因的轉錄、抑制ECM降解，并誘導腎小管內皮細胞向肌成纖維細胞分化[17, 18]。Smads家族是TGF-β1作用的關鍵性細胞內信號分子。其中，Smad3可被TGF-β1磷酸化，進而調節(jié)下游靶基因的轉錄[19]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad3信號通路是引起多種器官組織如肝、心、肺等纖維化的中心路徑[20-22]。本實驗結果顯示，與NC組相比，DC組中促炎因子如IL-1β、IL-6和TNF-α釋放明顯增多，TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3的表達水平均顯著增加，這表明TGF-β1/Smad3通路在STZ誘導的糖尿病大鼠腎纖維化過程中高度活化。NaHS處理后，DM+NaHS組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α釋放明顯降低，TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3表達水平明顯下調；而DM+PAG組中，IL-1β、IL-6和TNF-α釋放以及TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3表達水平較DC組均進一步增高，提示H2S可通過減少促炎因子釋放，下調TGF-β1/Smad3通路減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化。

綜上所述，H2S對糖尿病大鼠的腎臟纖維化具有重要的調節(jié)作用，其機制可能是通過減少促炎因子釋放，下調TGF-β1/Smad3通路，進而抑制腎臟col-IV的過量生成，而減輕糖尿病腎纖維化。