鄭 祥， 郭林峰， 戴明珠， 呂圭源， 陳素紅, 3△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 浙江 溫州 325035； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥與健康產(chǎn)品研究所， 杭州 310053； 3. 浙江工業(yè)大學(xué)長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心， 杭州 310014)

近年來不孕癥的發(fā)病率明顯逐年上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，不育夫婦占已婚育齡夫婦的7%～15%[1]。以體外受精-胚胎移植為代表的輔助生殖技術(shù)的孕育成功率僅維持在30%，胚胎著床障礙是主要原因[2]，改善胚胎著床障礙對提高輔助生殖技術(shù)的成功率和治療不孕癥具有重要意義[3]。孕康口服液(Yun Kang oral liquid，YK)是已上市的中成藥，具有補(bǔ)腎培元、益氣健脾、養(yǎng)血安胎之功效，臨床上用于腎虛型和氣血虛弱型的先兆流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)[4]。在妊娠初期，常因卵巢黃體分化、孕酮水平異常等，導(dǎo)致胚胎著床障礙[5]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)孕康口服液能改善腎虛致流產(chǎn)模型大鼠的癥狀，促進(jìn)卵巢黃體分化，提高雌激素、孕酮等激素水平[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用米非司酮致胚胎著床障礙大鼠模型[7]，進(jìn)一步觀察孕康口服液的安胎作用，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級SD大鼠，雌70只，體重(260±20)g；雄30只，體重(280±20)g。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：1703020027，許可證號：SCXK(浙)2014-0001。

1.2 試驗(yàn)藥物

回音必?孕康口服液(批號16070102)，現(xiàn)用現(xiàn)開，回音必集團(tuán)浙江齊齊制藥有限公司；地屈孕酮片(批號352536)、米非司酮片(批號170101)，浙江省中醫(yī)院西藥房提供。

1.3 試劑

卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)測試盒，批號均為E20170101A，上海源葉生物科技有限公司；HE試劑盒(批號20160918)，南京建成科技有限公司。

1.4 儀器

全自動(dòng)生化分析儀(TBA-40FR)，日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社；酶標(biāo)儀(Powerwave 340)，美國Bio-TEK公司；組織脫水機(jī)(JJ-12J)，武漢俊杰電子有限公司；切片機(jī)(RM2245)，德國LEICA公司；生物顯微鏡(B-5223IEP)，Motic公司。

1.5 動(dòng)物分組

每天下午5點(diǎn)，將一定數(shù)量的處于發(fā)情期或發(fā)情前期的雌鼠與雄鼠進(jìn)行合籠交配，每籠雌鼠與雄鼠的數(shù)量比例為1∶1，次日晨對合籠后的雌鼠進(jìn)行陰道栓檢查，以發(fā)現(xiàn)有陰道栓者記為雌鼠妊娠的第1日。將出現(xiàn)陰道栓的大鼠按體重隨機(jī)分為6組：正常對照組(NC)，模型組(MG)，地屈孕酮組(DT，3.02 mg/kg)，孕康口服液低劑量組(YK-L，4 ml/kg)、中劑量組(YK-M，6 ml/kg)、高劑量組(YK-H，9 ml/kg)，每組11只。

1.6 模型的建立及處理

從妊娠第1日起，除NC組、MG組灌服純化水外，其余各組按規(guī)定劑量灌服相應(yīng)受試藥，每天1次，連續(xù)10 d；期間在妊娠第3日，除NC組外，其余各組按5 mg/kg體質(zhì)量頸背部皮下注射米非司酮溶液建成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｈ焉锏?0日，水合氯醛麻醉后開腹暴露子宮，腹主動(dòng)脈采血備用，并取完整雙側(cè)卵巢、連胎子宮等備用。

1.7 檢測指標(biāo)

體重：實(shí)驗(yàn)全程每天稱量并記錄妊娠大鼠體重。

臟器指數(shù)測定：妊娠大鼠稱重、取血后，處死大鼠，解剖取卵巢、連胎子宮，計(jì)算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體重×100%。

胚胎著床數(shù)目：記錄胚胎著床數(shù)目。

連胎子宮形態(tài)觀察(拍照)：顏色，有無粘連、瘀血，有無丟失胚胎等。

血清指標(biāo)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定血清中FSH、IFN-γ、IL-4。檢測原理，預(yù)先包被抗體的微孔中依次加入材料，經(jīng)溫育、洗滌，用底物TMB顯色，顏色深淺與待測指標(biāo)成正相關(guān)。

連胎子宮病理學(xué)觀察：孕鼠連胎子宮用4%中性福爾馬林緩沖溶液固定24 h，經(jīng)脫水后，切制成4m厚的石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化，拍照記錄并分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 孕康口服液對體重的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，MG組給藥第6日體重明顯降低(P<0.05)，至第9日顯著降低(P<0.01)；與MG組比較，YK-M組僅第9日體重明顯升高(P<0.05)，DT組和YK-H組第6、9日體重均顯著性升高(P<0.05，0.01)，YK-L組則差異無顯著性；與DT組比較，YK各給藥組體重均無明顯差異(表1)。

2.2 孕康口服液對連胎子宮形態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組胚胎著床數(shù)目多，連胎子宮粗大如串珠狀呈粉紅色，宮內(nèi)未見瘀血；MG組胚胎著床數(shù)目少，連胎子宮呈竹節(jié)樣改變，或見壞死胚胎，或胚胎呈黑褐色，或無胚胎僅有胚胎著床點(diǎn)；YK-L組較MG組狀態(tài)佳，DT組和YK-M、YK-H組胚胎著床數(shù)目、連胎子宮形態(tài)均與NC組接近，其中YK-H組連胎子宮形態(tài)優(yōu)于DT組(圖1)。

GroupNumber of days of pregnancy(d)1369NC280.3±18.2292.6±17.2305.1±14.3318.5±12.5MG283.4±18.7290.8±21.4292.8±11.4?301.0±17.1??DT280.7±16.7294.7±15.3302.7±14.8#317.2±14.3#YK-L282.5±16.6295.9±15.3301.6±15.6310.7±16.9YK-M284.4±17.8295.1±20.9303.3±16.6319.1±18.7#YK-H287.1±17.6295.8±15.7307.0±15.2#320.9±14.0##

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid; L: Low dose group; M: Middle dose group; H: High dose group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsmodel group

Fig.1Effects of Yun Kang liquid on uterine morphology in embryo implantation dysfunction rats

A: Normal control B: Model group C: Dydrogesterone

D: YK-L E: YK-M F: YK-H

2.3 孕康口服液對卵巢、連胎子宮指數(shù)及胚胎著床數(shù)目的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，MG組連胎子宮指數(shù)、胚胎著床數(shù)目顯著降低(P<0.01)；與MG組比較，DT組和YK-M、YK-H組連胎子宮指數(shù)、胚胎著床數(shù)目均顯著性升高(P<0.05，0.01)，YK-L組則差異無顯著性；與DT組比，YK-H組連胎子宮指數(shù)、胚胎著床數(shù)目無顯著性差異。其中，YK-H組胚胎著床數(shù)目顯著高于YK-L和YK-M組(P<0.05， 0.01)，提示可能存在劑量依賴性。各組間卵巢指數(shù)無顯著性差異(表2)。

GroupOvarian index(mg/g)Uterine index(mg/g)Embryo implantation number(number)NC0.24±0.044.46±0.4516.27±2.41MG0.25±0.042.01±0.50??5.64±3.64??DT0.25±0.023.02±0.22##11.36±2.58##YK-L0.26±0.042.34±0.447.82±4.12YK-M0.24±0.022.66±0.53##9.45±3.78#YK-H0.26±0.022.98±0.30##12.82±2.86##△△▲

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vsYK-L;▲P<0.05vsYK-M

2.4 孕康口服液對FSH及IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，MG組血清FSH、IL-4水平明顯降低(P<0.05)；與MG組相比，YK-M、YK-H組血清FSH、IL-4水平均明顯升高(P< 0.05)，DT組和YK-L組則差異無顯著性。各組間血清IFN-γ水平無顯著性差異(表3)。

GroupFSH(IU/L) IFN-γ(pg/ml)IL-4(pg/ml)NC8.08±2.2269.53±17.9637.86±15.14MG6.51±0.60?66.77±8.7327.64±8.59?DT6.61±0.6772.00±7.4133.08±8.03YK-L7.02±0.7969.95±10.7332.69±4.27YK-M7.03±0.73#64.23±6.5334.62±4.85#YK-H7.10±0.81#67.31±11.1335.62±11.59#

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid; FSH: Follicle stimulating hormone; IFN-γ: Interferon-γ; IL-4: Interleukin-4

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.5 孕康口服液對連胎子宮病理切片的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組子宮內(nèi)膜層幾乎完全由圓形、類圓形單層柱狀上皮覆蓋；MG組子宮內(nèi)膜腺體擴(kuò)張，腺上皮增生、鱗狀化，腺腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤；YK-L、YK-M組部分腺體擴(kuò)張，YK-H組單層柱狀上皮微鱗狀化，YK各給藥組腺上皮增生、腺腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯改善(圖2)。

3 討論

胚胎著床是體外受精-胚胎移植生殖技術(shù)和正常妊娠過程中的關(guān)鍵步驟之一，子宮內(nèi)膜容受性是其中重要的制約因素[8]。子宮內(nèi)膜僅在一個(gè)極短的時(shí)間段內(nèi)允許發(fā)育到特定階段的胚胎黏附在子宮內(nèi)膜上，在這個(gè)短暫的“窗口”時(shí)間內(nèi)，子宮內(nèi)膜與胚胎需發(fā)育同步才能形成最優(yōu)的子宮內(nèi)膜容受性，使胚胎順利著床，否則會(huì)導(dǎo)致胚胎著床障礙，造成流產(chǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)大鼠在妊娠第3日頸背部皮下注射米非司酮，通過競爭性結(jié)合孕激素受體，造成下丘腦-垂體-性腺軸的紊亂，使機(jī)體激素異常分泌，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)育受到抑制而干擾著床[9]。本研究結(jié)果顯示，MG組胚胎著床數(shù)目和連胎子宮指數(shù)均顯著降低，連胎子宮形態(tài)異常，子宮內(nèi)膜病變明顯，成功構(gòu)建了胚胎著床障礙大鼠模型。

Fig.2Effects of Yun Kang oral liquid on uterine morphology in embryo implantation dysfunction rats

A: Normal control; B: Model group; C: Dydrogesterone; D: YK-L; E: YK-M; F: YK-H; 1: HE ×100; 2: HE ×400

孕康口服液是根據(jù)安徽省名老中醫(yī)楊新吾先生的驗(yàn)方“無憂保胎方”研制而成[10]，2015版中國藥典將其收錄為孕康合劑(孕康口服液)，臨床上用于先兆流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)[11]。孕康口服液具有補(bǔ)腎培元、益氣健脾、養(yǎng)血安胎之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明[12]，補(bǔ)腎方藥能調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸功能，改善子宮內(nèi)膜環(huán)境，增強(qiáng)子宮內(nèi)膜容受性，從而提高妊娠率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YK-M、YK-H組和DT組均能顯著性升高胚胎著床數(shù)目和連胎子宮指數(shù)，且YK-M、YK-H組與DT組比均無顯著性差異；YK-H組胚胎著床數(shù)目顯著高于YK-L組和YK-M組，提示孕康口服液可能存在劑量依賴性，但還需進(jìn)一步研究。同時(shí)，YK-H可使連胎子宮形態(tài)趨于正?；訉m內(nèi)膜病變明顯改善，利于安胎。

女性的生殖功能是在下丘腦-腺垂體-卵巢軸的共同調(diào)節(jié)下完成的，生殖軸中任何激素含量的改變都將影響生殖功能[13]，性成熟的子宮內(nèi)膜功能層的周期變化也受到下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)節(jié)，并與卵巢內(nèi)相應(yīng)的卵泡周期性活動(dòng)密切相關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與MG組比，YK-M、YK-H組均可升高血清FSH水平，DT組則差異無顯著性，提示孕康口服液可通過升高血清FSH水平刺激卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育成熟，促使黃體形成，改善子宮內(nèi)膜容受性，利于胚胎著床[15]。子宮內(nèi)膜的變化不僅需要性激素的調(diào)節(jié)，還需要免疫系統(tǒng)參與其中[16]。在正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜生長、分化、脫落和胚胎著床生長的內(nèi)膜重建過程中，免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子發(fā)揮著重要作用[17-19]，其中Th1/Th2的平衡與妊娠成功密切相關(guān)，Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-2過多會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)和反復(fù)流產(chǎn)，Th2型細(xì)胞因子如IL-4和IL-10有利于正常著床和妊娠，甚至妊娠成功被稱為是一種“Th2現(xiàn)象”[20]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與MG組比，YK-M、YK-H組均可明顯升高血清IL-4水平，表現(xiàn)為Th2型優(yōu)勢，促進(jìn)胚胎著床，利于妊娠，而DT組則差異無顯著性。

綜上所述，孕康口服液高劑量組能顯著性提高胚胎著床數(shù)目和連胎子宮質(zhì)量，升高血清FSH、IL-4水平，改善子宮內(nèi)膜組織學(xué)形態(tài)，從而提高子宮內(nèi)膜容受性，顯示出優(yōu)于地屈孕酮的安胎效果。孕康口服液可能通過調(diào)節(jié)激素水平和改善免疫細(xì)胞因子兩個(gè)方面促進(jìn)胚胎著床，改善子宮內(nèi)膜環(huán)境，提高胚胎數(shù)目和質(zhì)量，從而增加妊娠成功率，其機(jī)制有待更深入一步的研究，這為孕康口服液的臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。