胡古秀 李 陽 吳 華

（安徽省合肥市濱湖醫(yī)院，安徽 合肥 230061）

腦外傷（TBI）是神經(jīng)外科疾病之一［1］，由于其發(fā)病位置的特殊性，嚴(yán)重的TBI會(huì)使腦內(nèi)神經(jīng)受到損傷，同時(shí)，TBI還會(huì)引發(fā)多種并發(fā)癥和繼發(fā)障礙，如癲癇、腦積水、內(nèi)分泌功能障礙、中樞性尿崩癥等，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生命安全［2］。TBI引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥損傷是造成患者死亡的主要原因，因此探尋能夠減弱炎癥反應(yīng)的藥物是治療TBI的關(guān)鍵［3］。葛根素（Pue）是一種天然的抗氧化劑，具有對(duì)抗免疫、擴(kuò)張血管、降低血液黏度、改善微循環(huán)等作用，因此，不少學(xué)者將葛根素應(yīng)用于TBI的治療中［4-5］。本研究以建立的葛根素大鼠模型為研究對(duì)象，探究葛根素對(duì)TBI大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用，及潛在的分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠70只，SPF級(jí)，8～10 周齡，體質(zhì)量（150±20） g，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，許可證號(hào)：SYXK（京）2015-0045。

1.2 試藥與儀器 葛根素（山東省萊陽生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)：130752-201815）；納洛酮（北京市永康藥業(yè)有限公司，批號(hào)：160627）；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔抗鼠LC3-Ⅱ、p38MAPK、p-p38MAPK和GLT-1多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；3K15超低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD雙人凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇凈；引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 造模與分組 按照文獻(xiàn)資料，將大鼠稱體質(zhì)量，按1 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛進(jìn)行麻醉，頭部剪毛消毒后固定于腦立體定位儀上，于頭皮正中切開，剝離右側(cè)顱頂骨膜，用顱骨鉆刺一4 mm的骨窗，剝開硬腦膜，在腦表面放置直徑為3 mm的墊片，從20 cm高度落下40 g的祛碼撞擊墊片，建立TBI模型［6］。假手術(shù)組僅切開頭皮、左頂部開骨窗，不致TBI，模型組和假手術(shù)組均用牙科水泥固定骨孔處，待完全干燥后縫合頭皮，然后將大鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)48 h（排除手術(shù)和麻醉干擾），將大鼠脫頸椎處死，取出全腦，在體視顯微鏡下去除腦膜及血管后，記錄腦組織濕重（g），置于紅外線干燥箱將腦組織烘干至恒重，記錄其干重（g），計(jì)算6組大鼠腦組織含水量，含水量＝（濕重-干重）/濕重×100%。動(dòng)物分組，將造模成功的大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，分別命名為模型組、納洛酮組、葛根素低劑量組、P葛根素中劑量組、葛根素高劑量組，納洛酮組給予0.4 mg/kg納洛酮，葛根素組按低、中、 高劑量分別給予 20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg，所有大鼠均行灌胃治療，假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水，持續(xù)治療2周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 按照造模方法將大鼠麻醉，用75%酒精消毒2～3 min，在無菌的超凈臺(tái)剪開大鼠胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛灌注固定，直至肝臟變白、四肢僵硬，斷頭后用剪刀剪開頭皮及顱骨，取出全腦，在體視顯微鏡下去除腦膜及血管后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元存活率檢測(cè)。用冰凍切片機(jī)制作大腦皮層組織切成（不超過5 μm），室溫干燥后，用PBS（pH7.2左右）漂洗2～3次，干燥后用1%甲苯胺藍(lán)染色20 min，水洗后放入0.5%鹽酸乙醇溶液中分化，經(jīng)梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明（25 min），以中性樹膠封片。置于光鏡下觀察損傷灶周圍神經(jīng)元形態(tài)及計(jì)錄存活神經(jīng)元數(shù)量。皮質(zhì)神經(jīng)元存活率＝損傷側(cè)神經(jīng)元計(jì)數(shù)值/正常側(cè)神經(jīng)元計(jì)數(shù)值×100%。2）qRT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織中LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)水平。用RNA提取試劑盒提取6組大鼠腦組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)成cDNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)LC3-Ⅱ的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物 F1：5′-GAACAAAGAGTGGAAGATG-3′。下游引物 R1：5′-GCCGTCTGATTATCTTGA-3′，GAPDH：上游引物 F：5′-CGTTGGCTT CCCAGAACATCAT-3′。下游引物 R：5′-CATCGGACACATTGGGGGTAG-3′。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR。PCR的反應(yīng)體系為：5×緩沖液 10 μL，TaqDNA 聚合酶 1 μL， 上游引物 F 2 μL，下游引物 R 2 μL，10 mM dNTP mix 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL；PCR 的反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95 ℃5 min，變性95℃ 30 s，延伸59℃ 15 s（LC3-Ⅱ和GAPDH），40個(gè)循環(huán)，延伸時(shí)讀取光密度（D）值。采用最大二階導(dǎo)數(shù)法（2-△△Ct）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算 LC3-ⅡmRNA的相對(duì)表達(dá)量。3）免疫熒光染色檢測(cè)大鼠腦組織中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平。取分離的腦組織，用10%甲醛溶液固定后，取出損傷部位組織制作切片（厚度不超過10 μm），將組織切片在92～98℃條件下存放20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清用來中和非特異性反應(yīng)后，在組織玻片上滴加1∶200稀釋的兔抗鼠LC3-Ⅱ多克隆抗體，于4℃過夜放置，復(fù)溫后再組織玻片上滴加FITC二抗，于避光條件下室溫孵育1 h，用甘油封片后，于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察6組大鼠腦損傷組織中LC3-Ⅱ的表達(dá)情況，并采集照片（400 倍）。 4）Western blot檢測(cè) p38MAPK、p-p38MAPK和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（GLT-1）表達(dá)水平。分別向6組大鼠腦損傷組織中加入2 mL細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），每孔上樣體積 20 μL，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，分別滴加兔抗鼠p38MAPK、pp38MAPK和GLT-1多克隆抗體，置于4℃下過夜，滴加二抗37℃放置1 h。加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影，利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并利用Gel-Pro analyzer4軟件對(duì)SDS-PAGE電泳圖目的條帶進(jìn)行掃描，分析p38MAPK、p-p38MAPK和GLT-1表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦外傷模型的鑒定 見表1。模型組大鼠腦組織中的含水量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），結(jié)果提示腦外傷大鼠模型構(gòu)建成功。

表1 腦組織含水量的測(cè)定（±s）

表1 腦組織含水量的測(cè)定（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05。

組 別 n 腦組織含水量（%）假手術(shù)組 1071.32±8.67模型組 1090.64±9.37*

2.2 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元存活率 見表2。模型組大鼠的皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；納洛酮組和葛根素各劑量組大鼠的皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著高于模型組（P＜0.05）；且隨著葛根素劑量的增加，皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著提高（P＜0.05），呈劑量依賴性。

表2 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元存活率（%，±s）

表2 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元存活率（%，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與納洛酮組比較，#P＜0.05；與 Pue低劑量組比較，◇P＜0.05；與 Pue中劑量組比較，&P＜0.05。

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10納洛酮組 10皮質(zhì)神經(jīng)元存活率87.24±9.34 19.64±9.21*43.27±8.79*△葛根素低劑量組 10 28.13±12.26*△葛根素中劑量組 10 56.13±9.12*△#◇葛根素高劑量組 10 72.11±11.09*△#◇&

2.3 qRT-PCR檢測(cè)腦組織中LC3-ⅡmRNA表達(dá)水平 見表3。模型組大鼠腦組織中LC3-ⅡmRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；納洛酮組和葛根素各劑量組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨著葛根素劑量的增加，LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

表3 qRT-PCR檢測(cè)腦組織中LC3-ⅡmRNA表達(dá)情況（±s）

表3 qRT-PCR檢測(cè)腦組織中LC3-ⅡmRNA表達(dá)情況（±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10納洛酮組 10 LC3-ⅡmRNA 0.16±0.07 0.98±0.21*0.75±0.07*△葛根素低劑量組 10 0.61±0.11*△葛根素中劑量組 10 0.59±0.12*△#◇葛根素高劑量組 10 0.42±0.11*△#◇&

2.4 免疫熒光染色檢測(cè)腦組織中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平 見圖1。模型組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平高于假手術(shù)組；納洛酮組和葛根素組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平低于模型組；且隨著葛根素劑量的增加，LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平降低，呈劑量依賴性。

圖1 免疫熒光染色檢測(cè)腦組織中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平（400倍）

2.5 Western blot檢測(cè)腦組織中p38MAPK、p-p38MAPK和GLT-1表達(dá)水平 見圖2，表4。各組間大鼠腦組織中p38MAPK的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組大鼠腦組織中p-p38MAPK表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；納洛酮組和葛根素各劑量組大鼠腦組織中p-p38MAPK表達(dá)水平顯著低于模型組 （P＜0.05）；且隨著葛根素劑量的增加，p-p38MAPK表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。模型組大鼠腦組織中GLT-1表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；納洛酮組和葛根素各課題組大鼠腦組織中GLT-1表達(dá)水平顯著高于模型組（P＜0.05）；且隨著葛根素劑量的增加，GLT-1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），呈劑量依賴性。

圖2 Western blot檢測(cè)腦組織中p38MAPK、p-p38MAPK和GLT-1表達(dá)水平

表4 各組腦組織中38MAPK、p-p38MAPK、GLT-1的相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組腦組織中38MAPK、p-p38MAPK、GLT-1的相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

組別 n假手術(shù)組 10模型組 10納洛酮組 10葛根素低劑量組 10葛根素中劑量組 10葛根素高劑量組 10 p38MAPK 0.78±0.23 0.75±0.24 0.77±0.22 0.74±0.20 0.78±0.25◇0.77±0.26◇&p-p38MAPK GLT-1 0.54±0.21 1.18±0.17 1.18±0.35* 0.51±0.11*1.07±0.32*△ 0.80±0.09*△1.02±0.27*△# 0.63±0.10*△#0.85±0.28*△#◇ 0.65±0.11*△#◇0.76±0.27*△#◇& 0.94±0.16*△#◇&

3 討 論

TBI會(huì)引起嚴(yán)重的神經(jīng)損傷和炎癥反應(yīng)，輕則影響患者的認(rèn)知功能和肢體運(yùn)動(dòng)，重則威脅患者的生命安全?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)TBI的具體發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍處于探討階段，而中醫(yī)學(xué)對(duì)該病的病因病機(jī)有一定的理論分析［7］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，TBI歸于中醫(yī)外傷的范疇，腦部因暴力所傷，導(dǎo)致血絡(luò)受損，血溢于外，氣血虧虛，血不循經(jīng)，瘀血阻滯，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為腦水腫、腦積水和腦內(nèi)神經(jīng)受損［8-10］?；诖死碚摚狙芯坎捎渺畲a撞擊的方法建立TBI大鼠模型，并檢測(cè)腦組織含水量，結(jié)果表明模型組大鼠腦組織中的含水量顯著高于假手術(shù)組，提示腦外傷大鼠模型構(gòu)建成功。

TBI的病理特點(diǎn)是本虛標(biāo)實(shí)，以氣血虧虛為本，血瘀痰火為標(biāo)。因此TBI的治療應(yīng)以活血化瘀，補(bǔ)氣養(yǎng)血、益腎填精為主［8］。納洛酮是一種非專一性阿片受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，能夠抑制血管收縮增加血流量，減輕炎癥反應(yīng)，但是不能從根本上解決腦外傷后的神經(jīng)損傷。葛根素是從豆科植物葛根中提取的天然活性物質(zhì)，其主要有效成分是黃酮類。近年來，不少學(xué)者將葛根素應(yīng)用于TBI的治療中。趙海臣等研究表明，葛根素注射液能夠明顯改善TBI患者臨床癥狀，療效顯著［11］。李國(guó)亮等研究表明，葛根素可以減輕顱腦水腫、并通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用［5］。還有研究表明，葛根素可以調(diào)節(jié)大鼠顱腦損傷后ICAM-1和NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用［12］。在腦外傷中自噬與腦組織和神經(jīng)損傷密切相關(guān)，LC3是一種自噬相關(guān)蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型之分，未發(fā)生自噬時(shí)主要以LC3-Ⅰ的形式存在，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化修飾形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是判斷自噬活性的重要分子標(biāo)記物［13-14］。本研究表明，葛根素能夠提高TBI大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率，且隨著葛根素劑量的增加，皮質(zhì)神經(jīng)元的存活效率顯著增加；同時(shí)，葛根素能夠降低大腦皮層中神經(jīng)元自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ表達(dá)水平，且隨著Pue劑量的增加，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平顯著降低，提示Pue對(duì)腦外傷大鼠神經(jīng)具有保護(hù)作用。

p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路能夠參與生物體多種生命活動(dòng)，近年來不少學(xué)者表明，p38MAPK與腦外傷后神經(jīng)元自噬和神經(jīng)損傷密切相關(guān)。徐小涵等研究表明，葛根素通過下調(diào)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中p38MAPK的表達(dá)水平，進(jìn)而減弱海馬神經(jīng)元凋亡［15］。除此之外，p38MAPK通路在自噬反應(yīng)中也具有重要作用，陳祥榮等人研究表明，通過抑制p38MAPK通路能夠減弱自噬反應(yīng)，具有保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)的作用［16］。劉瑤等研究表明，抑制p38MAPK通路能夠調(diào)控腦缺血后海馬神經(jīng)元自噬，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能［17］。腦外傷會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸大量釋放，研究表明，高濃度的谷氨酸會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性，甚至導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［18］，而GLT-1能夠?qū)⒐劝彼徂D(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，谷氨酸在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺，因此，上調(diào)表達(dá)GLT-1能夠減輕腦外傷后的神經(jīng)元自噬和神經(jīng)損傷［19］。本研究表明，葛根素能夠下調(diào)p-p38MAPK表達(dá)，同時(shí)能夠上調(diào)GLT-1表達(dá)，且隨著Pue劑量的增加，p-p38MAPK的表達(dá)水平顯著下降、GLT-1的表達(dá)水平顯著提高，且呈劑量依賴性。結(jié)果提示，葛根素能夠下調(diào)p-p38MAPK表達(dá)、上調(diào)GLT-1表達(dá)，進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

綜上所述，葛根素對(duì)TBI大鼠神經(jīng)具有保護(hù)作用，這一作用可能通過抑制p38MAPK通路活性和上調(diào)GLT-1的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的，為腦外傷靶向藥物的開發(fā)和治療供一定的理論基礎(chǔ)。

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