楊晨羲 宣桂琪 阮曉琳 周星星 陳 健△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州310006）

第3次中國(guó)城市兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查顯示2010年全國(guó)城市14歲以下兒童哮喘的累積患病率為3.02%，嚴(yán)重影響我國(guó)青少年的身心健康，防治兒童哮喘是兒科疾病的重點(diǎn)和難點(diǎn)［1-2］。前期臨床實(shí)踐證明臨床經(jīng)驗(yàn)方防哮方治療緩解期哮喘兒童有良好療效，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)防哮方可改善哮喘大鼠氣道重塑，抑制ERKl/2 mRNA及P-ERKl/2蛋白的表達(dá)［3］。本實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）為切入點(diǎn)，觀察防哮方對(duì)哮喘大鼠Th1/Th2型細(xì)胞因子水平的影響，探討其能否在改善Th1/Th2失衡方面發(fā)揮作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)6周齡SD大鼠，雄性，48只，體質(zhì)量180～200 g。由中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障環(huán)境中，許可證號(hào)：SYXK（浙）2008-0116。

1.2 試藥與儀器 中藥復(fù)方防哮方（南沙參6 g，北沙參 6 g，麥冬 9 g，地骨皮 3 g，生石決明 10 g，生白芍6 g，黨參 6 g，茯苓 10 g，白術(shù) 6 g，姜半夏 6 g，陳皮 5 g）購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。中藥制劑煎煮濃縮至生藥質(zhì)量濃度0.5 g/mL（低）、1 g/mL（中）、2 g/mL（高）3個(gè)質(zhì)量濃度的藥汁。醋酸地塞米松片（7.5 mg/片，購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：1410202）。 卵白蛋白（OVA）：美國(guó) Sigma公司。超純RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、5x RNA Loading Buffe： 大連 TaKaRa 公司。 IL-4、IFN-γ mRNA引物及β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，詳見表1。PTC-200型PCR儀、iQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

表1 大鼠相關(guān)引物序列

1.3 造模與分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組、模型組及中藥低、中、高劑量組及地塞米松組共6組，每組8只。參照文獻(xiàn)調(diào)整改進(jìn)，制備哮喘大鼠模型，致敏、激發(fā)階段：除正常組外，其余各組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)的第1、8日在腹腔、前后腿內(nèi)側(cè)4點(diǎn)各注射0.2 mL OVA致敏。第15日開始，于自制的簡(jiǎn)易霧化箱中用泵霧化器以一定濃度的OVA 0.9%氯化鈉注射液霧化激發(fā)，每次30 min，隔日1次，共持續(xù)8周。激發(fā)濃度第1、2周按1%，第3、4周按1.5%，第5、6周按2%，第7、8周按2.5%。正常組予等量的0.9%氯化鈉注射液霧化吸入。以呼吸急促、嗆咳煩躁、四肢搔抓及輕度紫紺等哮喘癥狀出現(xiàn)為激發(fā)成功［4］。第9周起給藥，參考體表面積法［5］，大鼠等效給藥量（g/kg）＝6.25×成人給藥量（g/kg）。中藥低、中、高劑量組給藥劑量按等效給藥量的 0.5 倍、1 倍、2 倍，具體為 4 g/（kg·d）、8 g/（kg·d）、16 g/（kg·d）；正常組及模型組以等量0.9%氯化鈉注射液代替中藥灌胃；地塞米松組則予地塞米松0.75 mg/（kg·d）灌胃，上述灌胃均每日1次，連續(xù)2周。

1.4 標(biāo)本采集及檢測(cè) 標(biāo)本留取：末次給藥后24 h予10%水合氯醛8 mL/kg腹腔麻醉處死大鼠，開胸暴露左、右肺臟。左肺用磷酸緩沖溶液（PBS）灌洗支氣管肺泡，參照文獻(xiàn)［6］收集肺泡灌洗液（BALF），離心后-4℃冰箱保存。右肺剪取部分組織，用PBS洗凈，潤(rùn)干，凍存?zhèn)溆?，用于RT-PCR檢測(cè)。BALF分類計(jì)數(shù)及指標(biāo)檢測(cè)：BALF中加1 mL PBS液重懸，混勻，取50 μL回收液，并用2%白細(xì)胞（WBC）稀釋液進(jìn)行60倍稀釋。取10 μL稀釋液在顯微鏡下觀察并用血球計(jì)數(shù)板對(duì)WBC總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。取適量回收液制備細(xì)胞涂片，采用吉姆薩染色，高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)，并計(jì)算嗜酸粒細(xì)胞（EOS）百分比。RT-PCR 法檢測(cè) IL-4、IFN-γ mRNA 表達(dá)，嚴(yán)格按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照2-△△CT相對(duì)定量計(jì)算公式，計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用方差分析（ANOVA），方差齊性則采用LSD法，方差不齊則采用Tamhane′s T2法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠BALF中WBC總數(shù)及EOS百分率比較見表2。與正常組比較，模型組WBC總數(shù)、EOS百分率均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比，各中藥組及地塞米松組WBC總數(shù)、EOS百分率明顯減少（P＜0.05）；與地塞米松組相比較，中藥低、中劑量組WBC總數(shù)、EOS百分率較高（P＜0.05），但中藥高劑量組差別不明顯（P ＞0.05）。

表2 各組大鼠BALF中WBC總數(shù)和EOS百分率比較（±s）

表2 各組大鼠BALF中WBC總數(shù)和EOS百分率比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，#P＜0.05。 下同。

組 別 n WBC總數(shù)（×105/mL） EOS百分率（%）正常組 8 69.250±10.525 5.250±1.982模型組 8 206.500±36.967* 24.375±8.798*中藥低劑量組 8 154.500±9.841△# 14.000±3.664△#中藥中劑量組 8 128.750±13.604△# 16.000±3.162△#中藥高劑量組 8 98.500±16.860△ 1.563±0.035△地塞米松組 8 85.250±10.740△ 6.500±1.772△

2.2 各組大鼠肺組織IL-4、IFN-γ水平表達(dá)比較 見表3。與正常組相比，模型組IL-4水平升高、IFN-γ水平降低（均P＜0.05）；與模型組相比，各中藥組及地塞米松組IL-4水平明顯降低、IFN-γ水平明顯升高 （均P＜0.05），中藥低、中、高劑量組與地塞米松組變化趨近；中藥高劑量組與地塞米松組相比，IL-4水平較高（P＜0.05），IFN-γ 水平變化不明顯（P＞0.05）。

表3 各組大鼠肺組織中IL-4及IFN-γ mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織中IL-4及IFN-γ mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

組 別 n IL-4 mRNA（2-△△CT） IFN-γ mRNA（2-△△CT）正常組 8 1.027±0.039 1.028±0.032模型組 8 2.316±0.086* 0.626±0.027中藥低劑量組 8 2.107±0.044△# 0.730±0.013△#中藥中劑量組 8 1.929±0.043△# 0.834±0.018△#中藥高劑量組 8 1.563±0.035△# 0.945±0.026△地塞米松組 8 1.217±0.022△ 0.946±0.088△

3 討 論

防哮方是全國(guó)老中醫(yī)藥專家、浙江省名中醫(yī)、本文第二作者宣桂琪教授治療兒童哮喘緩解期的經(jīng)驗(yàn)方。他認(rèn)為小兒“陽(yáng)常有余、陰常不足”，結(jié)合小兒“肺、脾、腎常不足，肝常有余”的生理特點(diǎn)，哮喘患兒以體虛肝旺的體質(zhì)較多，哮喘緩解期多以氣陰兩虛分型［7-8］。本方由生脈散和六君子湯劃裁而成，方中南、北沙參養(yǎng)陰清肺，潤(rùn)燥生津，麥冬養(yǎng)胃陰以生肺陰；合六君子湯，益氣健脾，燥濕化痰，乃培土生金之法；白芍配石決明養(yǎng)肝陰平肝柔肝，佐以地骨皮滋陰清熱，防木火刑金而肺熱難清［9-10］。全方肺脾肝三臟同調(diào)，以益氣健脾，養(yǎng)陰止咳為主，并佐以平肝柔肝之品，以圖調(diào)整患兒脾虛肝旺的體質(zhì)，宣教授臨床多用此方辨證加減，可明顯減少哮喘發(fā)作次數(shù)，改善患兒體質(zhì)。

氣道慢性炎癥和氣道重塑是支氣管哮喘的主要病理特征，研究表明免疫功能紊亂在哮喘發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，其中Th1、Th2比例及功能失衡，具體表現(xiàn)為Th1細(xì)胞功能下降，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，是哮喘形成和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)和始動(dòng)因素［11-12］。Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，IFN-γ被認(rèn)為是其特征性的主要細(xì)胞因子。IFN-γ具有調(diào)節(jié)EOS活化、分化和募集的作用，可以下調(diào)EOS趨化因子受體的表達(dá)，抑制EOS浸潤(rùn)作用［13］。IFN-γ還能抑制IL-4對(duì)B細(xì)胞的走向調(diào)節(jié)，從而抑制IgE生成。Th2主要參與B細(xì)胞增殖、抗體產(chǎn)生及速發(fā)型的超敏反應(yīng)，其分泌的IL-4在Th細(xì)胞分化過程中能調(diào)控單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，從而促進(jìn)Th2的發(fā)育分化，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生及釋放IgE，促進(jìn)肥大細(xì)胞活化，募集與活化EOS，從而導(dǎo)致氣道炎癥、氣道高反應(yīng)及氣道重塑［14-15］。高志剛相關(guān)臨床研究提示哮喘患兒血清中高水平的IL-4可以促進(jìn)小兒哮喘氣道高反應(yīng)性形成［16］。在哮喘的發(fā)病過程中，Th1/Th2平衡被打破，免疫反應(yīng)傾向Th2，使Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ）分泌減少，Th2 型細(xì)胞因子（IL-4）分泌增多。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組IL-4水平、WBC總數(shù)及EOS百分率較正常組明顯升高，說(shuō)明哮喘模型大鼠激活Th2細(xì)胞，促進(jìn)IL-4及炎癥細(xì)胞釋放增多。模型組IFN-γ水平較正常組明顯減少，說(shuō)明哮喘模型大鼠Th1細(xì)胞功能下降，IFN-γ分泌減少。與模型組比，各中藥組及地塞米松組IL-4水平、WBC總數(shù)及EOS百分率明顯下降，說(shuō)明各治療組均能下調(diào)IL-4及炎癥細(xì)胞的表達(dá)，抑制Th2細(xì)胞功能。與模型組比，各中藥組及地塞米松組IFN-γ水平明顯升高，說(shuō)明各治療組均能促進(jìn)Th1細(xì)胞功能，上調(diào)IFN-γ表達(dá)。其中中藥高劑量組WBC總數(shù)、EOS百分率及IFN-γ水平與地塞米松組相比無(wú)明顯差異，說(shuō)明中藥高劑量組與地塞米松組在調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子，改善氣道炎癥方面作用相當(dāng)。綜上所述，防哮方通過對(duì)IFN-γ/IL-4細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，上調(diào)IFN-γ水平，下調(diào)IL-4水平，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫紊亂，有利于改善氣道炎癥，其在防治哮喘方面發(fā)揮的作用可能與此有關(guān)。但其具體機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步深入研究。

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