宋欠紅 樊 睿 朱虹江 李云華 羅慶文 葉 勇 趙 淳

（云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650021）

膿毒癥（Sepsis）是臨床難治、多發(fā)病［1］。 在 ICU 患者中發(fā)病率高，耗費大量醫(yī)療資源。盡管醫(yī)療技術(shù)日漸進步，但病死率仍較高達30%～70%［2］。膿毒癥的大部分臨床表現(xiàn)有發(fā)熱，屬中醫(yī)學(xué)“外感熱病”“溫毒”等范疇［3］。膿毒癥并發(fā)心臟損害是其致死的重要危險因素。中醫(yī)藥治療膿毒癥可通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮治療作用［4-5］。清毒提取液是本文通信作者全國名中醫(yī)趙淳教授治療膿毒癥氣分熱毒型的常用方劑，臨床療效顯著。本實驗通過觀察清毒提取液對膿毒癥大鼠血清肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、B型尿鈉肽（BNP）及心肌組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平的調(diào)節(jié)，探討其對膿毒癥大鼠心肌損傷的修復(fù)作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量260～300 g， 生產(chǎn)許可證號：SCXK （滇）2015-0003，合格證號：430067000007126，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。大鼠自由飲水進食，實驗前1周在實驗環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，濕度 40%～70%。

1.2 試藥與儀器 清毒提取液制備，具體組方為生大黃 15 g，炒黃連 15 g，炒黃芩 10 g，黃柏 10 g，梔子15 g［6-7］。 以上 5 味，共 10 劑劑量。 藥物浸泡 30 min，水煎2次，首煎生大黃后下10 min。加6倍量水，每次煎20 min，2次藥液混勻。減壓濃縮經(jīng)0.2 μm過濾器過濾并調(diào)整質(zhì)量濃度至 1 g/mL（按生藥計算）［8-9］。由云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院制劑室提供。注射用烏斯他汀購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。cTnⅠ試劑盒由拜耳公司提供；BNP試劑盒由羅氏公司提供；SOD試劑盒由Thermo Fisher公司提供；考馬斯亮藍由北京索萊寶科技有限公司提供；MDA試劑盒由上海信?？萍加邢薰咎峁?。FA/JA型電子天平由上海方瑞儀器有限公司生產(chǎn)；723 SPC型分光光度計由上海奧析科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；PSD800型離心機由蘇州星億機械有限公司生產(chǎn)。

1.3 造模與分組 1）分組及給藥：將大鼠用隨機數(shù)字表法隨機分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組、烏斯他汀組各10只，清毒提取液低劑量組、清毒提取液中劑量組和清毒提取液高劑量組各20只。清毒提取液成人每日用量為65 g，實驗大鼠與成人用藥量按照成人與大鼠體質(zhì)量比例計算，方法：成人用量（以體質(zhì)量70 kg計）×0.0026×50=大鼠用量/kg 體質(zhì)量［10］。 清毒提取液低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予4.25 mL/kg、8.5 mL/kg、17 mL/kg。于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)前1 h和術(shù)后24 h、48 h、72 h、84 h 分別給大鼠清毒提取液灌胃、生理鹽水灌胃、烏斯他汀靜脈注射。假手術(shù)組和模型組予以生理鹽水10 mL/kg灌胃。烏斯他汀組予以注射用烏斯他汀13000 U/kg尾靜脈注射。注射用烏斯他汀10萬單位加入0.9%氯化鈉10 mL，使用針頭，左側(cè)尾靜脈注射。2）動物模型制作：參照陸焱等［11］報道的方法基礎(chǔ)上進行改良，復(fù)制腹腔感染型膿毒癥大鼠模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。在下腹部正中切長約2 cm切口，分離盲腸與大腸的系膜，將腸腔內(nèi)糞便擠向遠端，用滅菌3號絲線結(jié)扎盲腸，保持腸道通暢。在結(jié)扎范圍內(nèi)用12號針頭穿刺兩次腸壁，形成腸瘺，兩個針孔相距約3 mm，為防止傷口愈合在第2針孔內(nèi)放置一條寬2 mm的橡膠引流片。關(guān)閉腹腔，逐層縫合。為補充手術(shù)過程中體液的丟失術(shù)后立即皮下注射生理鹽水，劑量1 mL/100 g體質(zhì)量。假手術(shù)組只打開腹腔，不盲腸造瘺，然后逐層縫合腹壁。

1.4 標(biāo)本采集 于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后96 h使用10%水合氯醛（2.4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定。于股動脈處取血約3 mL，待血液在試管中自然凝固后，予以離心，取上清液即血清分裝于ependor管置于-20℃冰箱，進行檢測血清cTnⅠ、BNP。股動脈取血后，迅速打開胸腔，取左心室室壁組織3 mm×3 mm，剪碎，研磨，離心取上清液，左心室勻漿上清液在冰浴下使用磷酸鹽緩沖液制成10%組織勻漿液，離心取上清液以備檢測心肌組織MDA含量及 SOD 活性［12］。

1.5 觀察指標(biāo) 1）大鼠血清cTnⅠ、BNP檢測：ELISA試劑盒嚴(yán)格按照說明書操作，進行檢測。2）MDA含量的測定：取制備的左心室勻漿上清液，按照試劑說明書依次加試劑，混勻，沸水浴，離心取上清液，于532 nm處測光密度［13］。采用硫代巴比妥酸法測定。3）SOD活性的測定：采用黃嘌呤氧化酶法測定。根據(jù)說明書操作后，讀取440 nm下各組吸光度。以上檢測均嚴(yán)格按照說明書操作，用考馬斯亮藍法測定組織的蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清cTNⅠ、BNP水平比較 見表1。清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，使用清毒提取液治療后cTnⅠ水平均有降低（均P＜0.05）；清毒提取液低、高劑量組與模型組比較，可降低BNP水平（均P＜0.05）；清毒提取液中、高劑量組與烏斯他汀組比較，cTnⅠ差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），清毒提取液低、高劑量組與烏斯他汀組比較，BNP差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表 1 各組血清 cTnⅠ、BNP水平比較（ng/mL，±s）

表 1 各組血清 cTnⅠ、BNP水平比較（ng/mL，±s）

與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n cTnⅠ BNP假手術(shù)組 10 0.13±0.02 1.02±0.21模型組 4 1.85±0.22 4.89±0.53烏斯他汀組 6 0.79±0.11 2.83±0.39清毒提取液低劑量組 11 1.28±0.19△ 3.11±0.43△清毒提取液中劑量組 15 0.91±0.17△ 4.33±0.51清毒提取液高劑量組 16 0.74±0.12△ 3.04±0.45△

2.2 各組心肌組織MDA、SOD水平比較 見表2。清毒提取液中、高劑量組與模型組比較，MDA水平均有降低（P＜0.05）；清毒提取液高劑量組與模型組比較，可以提高SOD水平（P＜0.05）；清毒提取液中、高劑量組與烏斯他汀組比較，MDA差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；清毒提取液高劑量組與烏斯他汀組比較，MDA差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組心肌組織MDA、SOD水平比較（±s）

表2 各組心肌組織MDA、SOD水平比較（±s）

組 別 n MDA（μmol/mg） SOD（U/mg）假手術(shù)組 10 0.43±0.08 14.02±1.21模型組 4 1.85±0.22 8.89±1.53烏斯他汀組 6 0.79±0.11 12.33±1.39清毒提取液低劑量組 11 1.48±0.31 9.11±1.43清毒提取液中劑量組 15 0.91±0.17△ 9.03±1.41清毒提取液高劑量組 16 0.74±0.21△ 12.04±1.88△

3 討 論

心肌損傷是膿毒癥常見的臟器損害，常表現(xiàn)為心律失常、心肌供血不足和心力衰竭，一旦出現(xiàn)心力衰竭常導(dǎo)致其他器官功能的進一步惡化［14］。其主要病機為熱毒熾盛，耗傷氣陰，心氣陰兩虛。臨床以發(fā)熱、面赤、胸悶、心悸、乏力、氣短、舌質(zhì)紅、苔黃膩，脈滑數(shù)為主要表現(xiàn)。其根本原因?qū)贌岫窘瑲夥譄崾?，故?yīng)用清熱解毒，瀉火攻下之法。臨床研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用清毒提取液能夠緩解患者上述證候，并能降低患者心肌損傷、心力衰竭標(biāo)志物如cTnⅠ、BNP的水平。

清毒提取液為黃連解毒湯加大黃而成，以大黃、黃連、黃芩、黃柏、梔子按 3∶3∶2∶2∶3 比例組方［15-16］。 其不僅瀉火解毒力強，且有引熱下行之功，使熱邪從大腸而解。該方是本文通信作者全國名中醫(yī)趙淳教授治療膿毒癥氣分熱毒型的常用方劑，臨床療效顯著，其組方原則主要是根據(jù)膿毒癥主要病機即菌、毒、炎浸淫三焦，三焦熱盛，熱毒內(nèi)侵，熱擾心神，熱毒耗傷心氣、心陰所確定。

應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制的膿毒癥模型，其膿毒癥機制符合熱毒蘊結(jié)陽明大腸，陽明熱盛、陽明腑實的特點。因腸道有多種細菌，形成腸瘺后，細菌快速繁殖，并產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，故膿毒癥發(fā)生急劇、嚴(yán)重，心肌損害產(chǎn)生比較典型。該方具有清熱解毒、瀉火攻下，蕩滌濕熱毒邪之功，屬釜底抽薪之法。三黃清解三焦火毒，梔子引邪從小便而出，大黃瀉火攻下，清解陽明熱毒，蕩滌濕熱毒邪?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芩具有解熱、抑菌、抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化作用。黃連能夠興奮心臟、增強心肌收縮力、增加冠脈血流量、抗心律失常作用。黃柏具有抗炎、降壓作用。梔子具有解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素作用。大黃能增加腸蠕動、促進排便，抗動脈粥樣硬化，改善血液循環(huán)，保護腸屏障功能調(diào)節(jié)免疫作用［17］。

本實驗發(fā)現(xiàn)膿毒癥狀態(tài)下cTnⅠ、BNP增高，證明膿毒癥狀態(tài)下大鼠心肌存在不同程度地損傷。清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，3組cTnⅠ水平均有降低；清毒提取液低、高劑量組與模型組比較，BNP水平均有降低。cTnⅠ、BNP 2項指標(biāo)主要從心肌損傷及心力衰竭的程度方面反映膿毒癥對心臟的損害［18］，清毒提取液降低cTnⅠ、BNP的水平，證明清毒提取液可有效降低膿毒癥心臟損害。清毒提取液中、高劑量組與模型組比較，心肌MDA水平均降低；清毒提取液高劑量組與模型組比較，可提高心肌SOD水平，證明高劑量清毒提取液可提高SOD活力，降低 MDA含量。其作用機理可能是全方發(fā)揮解熱、抑菌、抗內(nèi)毒素、清除氧自由基協(xié)同作用，特別是黃連能夠興奮心臟、增強心肌收縮力、增加冠脈血流量；大黃能改善血液循環(huán)，保護腸屏障功能［19］。本實驗初步顯示，清毒提取液是治療膿毒癥心肌損傷的有效方法，其更深入的作用機理有待進一步研究。

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