朱珍珍 李青霞 鄧嘉儀 鄭梓唯 趙鋆偉 唐建洲

（長(zhǎng)沙學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410022）

南美白對(duì)蝦自從引進(jìn)以來(lái)就深受廣大對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)者的喜愛(ài)，養(yǎng)殖規(guī)模就迅速擴(kuò)大，短短幾年時(shí)間就發(fā)展成我國(guó)養(yǎng)殖面積最廣的對(duì)蝦。然而，近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和放養(yǎng)密度的增加，由細(xì)菌和病毒性疾病引發(fā)的病害也日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已成為當(dāng)前限制凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。我國(guó)具有豐富的植物資源，應(yīng)用植物藥來(lái)防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病有著悠久的歷史[1]。植物藥具有天然、環(huán)保、無(wú)藥物殘留、對(duì)病原微生物不易產(chǎn)生抗藥性、毒副作用較小等優(yōu)點(diǎn)，也能提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗應(yīng)激能力，因此植物藥的開(kāi)發(fā)和利用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，對(duì)飼料工業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及環(huán)境保護(hù)與人類(lèi)健康都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

五倍子為蚜科昆蟲(chóng)角倍蚜或倍蛋蚜在其寄主鹽膚木、青麩楊或紅麩楊等樹(shù)上形成的蟲(chóng)癭，異名文蛤、百蟲(chóng)倉(cāng)、木附子等。研究表明，五倍子具有很強(qiáng)的抗菌作用，主要藥效成分單寧酸（Tannin Acid），又稱(chēng)丹寧、鞣酸或鞣質(zhì)。植物單寧酸具有天然、高效等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。臨床研究表明五倍子佐以慶大霉素、甲硝哇能增強(qiáng)殺菌效果，特別對(duì)銅綠假單抱菌、厭氧菌的作用尤為顯著，五倍子對(duì)羊毛樣抱子菌等真菌也有較強(qiáng)的抑制作用[2]。

本文對(duì)傳統(tǒng)的鹽酸提取法進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了五倍子提取物對(duì)弧菌的抑制作用，為南美白對(duì)蝦健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 五倍子

本實(shí)驗(yàn)所采用的五倍子為藥店購(gòu)買(mǎi)。

1.1.2 弧菌

本實(shí)驗(yàn)室保存的弧菌有副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562。

1.1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基主要為2216E液體培養(yǎng)基、2216E固體培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。2216E 半固體培養(yǎng)基配置方法：按照質(zhì)量比 1：1 的比例稱(chēng)分別取 2216E 固體培養(yǎng)基與 2216E液體培養(yǎng)基，后加入適量蒸餾水備用[3]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五倍子提取物的制備

采用超聲波法優(yōu)化傳統(tǒng)提取工藝提取五倍子有效成分，并采用液相色譜的方法分析提取物的濃度和純度。

1.2.2 單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以溶劑濃度、溶劑倍量、超聲波時(shí)間和超聲波頻率為單因子水平開(kāi)展提取實(shí)驗(yàn)[4]（表1）。

表1 超聲波提取單因子參數(shù)

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用正交表，對(duì)五倍子沒(méi)食子酸提取率影響最大的四個(gè)因素鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時(shí)間和超聲波頻率4個(gè)因素，選擇3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)選。超聲方法為間歇超聲，即每超聲3秒，間歇3秒（見(jiàn)表2）。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.4 實(shí)驗(yàn)菌株的活化

實(shí)驗(yàn)室保存的副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562三種弧菌凍干粉，進(jìn)行活化處理，分別接種于2216E液體培養(yǎng)基中，溫度28℃、轉(zhuǎn)速180r/min的搖床上培養(yǎng)，備用。

1.2.5 體外弧菌抑制實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)不同濃度五倍子提取物對(duì)副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562的抑制作用，設(shè)計(jì)五倍子提取物的濃度梯度0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/ml，研究五倍子提取物的體外抑制弧菌效果，獲得抑制弧菌生長(zhǎng)與繁殖的最佳五倍子提取物濃度[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子提取物含量分析

五倍子提取物標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)樣量為10μl，保留時(shí)間為4.851min，峰面積為3226273。

2.2 單因子實(shí)驗(yàn)對(duì)五倍子提取物的提取量的影響

2.2.1 鹽酸濃度對(duì)五倍子提取物提取量的影響

用不同倍量的鹽酸水解五倍子粉末后所檢測(cè)出的峰面積是不同的，但是當(dāng)變量是溶劑倍量時(shí)，峰面積的大小不能代表沒(méi)食子酸的含量。但是，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)出的濃度與峰面積的關(guān)系。就可以通過(guò)不同倍量峰面積大小求出相應(yīng)的沒(méi)食子酸濃度，再用濃度乘以相應(yīng)水解倍數(shù)（10倍、20倍、30倍、40倍、50倍）便能得到?jīng)]食子酸含量。在鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時(shí)間和超聲波頻率一定的條件下，當(dāng)鹽酸濃度為1mol/L時(shí)，其液相色譜峰面積最大，能提取出五倍子有效成分的含量最多，此為最佳濃度。

2.2.2 溶解倍數(shù)對(duì)五倍子提取物提取量的影響

五倍子粉末在酸性溶液（HCl）中水解后，其中的主要成分—鞣質(zhì)被水解成沒(méi)食子酸，然后將其置于超聲波儀器中提取，最后用高效液相色譜法（HCLP）檢測(cè)其中的沒(méi)食子酸含量。在鹽酸濃度為6M時(shí)，進(jìn)料量為10μl，當(dāng)溶解倍數(shù)為20倍時(shí)，五倍子提取物的液相色譜圖的峰面積值最大，所以由此得出提取五倍子提取物的最佳溶解倍數(shù)為20倍。

2.2.3 超聲波時(shí)間對(duì)五倍子提取物提取量的影響

沒(méi)食子酸的含量測(cè)定采用HPLC法。具體方法為：五倍子粉末在酸性溶液（HCl）中水解后，其中的主要成分—鞣質(zhì)被水解成沒(méi)食子酸，然后將其置于超聲波儀器中提取，將提取液在12000rpm、5min條件下離心后，進(jìn)樣。在進(jìn)料量為10μl，鹽酸濃度為6M，提取五倍子提取物的超聲波時(shí)間是5min時(shí)，峰面積最大，則此時(shí)間為最佳提取時(shí)間。

2.2.4 超聲波時(shí)頻率對(duì)五倍子提取物提取量的影響

當(dāng)變量是超聲波提取功率時(shí)，峰面積的大小正是代表了所提取出的沒(méi)食子酸的含量。由圖5可知，超聲波功率在40～200W范圍之間時(shí)，峰面積大小變化是沒(méi)有準(zhǔn)確的規(guī)律可循的，但是超聲波功率調(diào)整到200W之后，峰面積與超聲波功率呈正比關(guān)系，而后，峰面積大小與超聲波功率呈負(fù)相關(guān)。在其他條件不變、超聲波提取功率在240W時(shí)，其液相色譜峰面積最大。所以提取五倍子主要物質(zhì)—鞣質(zhì)時(shí)，最佳的超聲波提取功率為240W。

2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)下五倍子提取物的最佳提取條件

最佳的提取五倍子提取物的條件是1mol/L HCl、溶解倍數(shù)為20倍、超聲波20min 和頻率240W。

2.4 不同濃度的鹽酸提取的五倍子提取物抑菌效果

在一定的條件下，五倍子提取物濃度的越高，其對(duì)副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌等弧菌的抑制作用也越大，且隨著五倍子提取物的濃度的提高，其對(duì)弧菌的抑制效果增大，呈線(xiàn)性關(guān)系。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)五倍子提取物的提取率進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，五倍子天然抗菌物質(zhì)的提取采用超聲輔助酸提取法，結(jié)果表明，鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時(shí)間和超聲波頻率對(duì)五倍子提取物的提取量均有影響。最佳提取工藝條件為：1mol/L HCl、溶劑的溶解倍數(shù)為20倍、超聲波提取時(shí)間為20min 和頻率240W。

五倍子是一種天然的植物抑菌物質(zhì)，我們采用鹽酸溶解五倍子粉末，通過(guò)用探究到的最佳提取工藝條件，得到五倍子提取物，并考察了該提取物對(duì)供試的3種病原菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)五倍子鹽酸提取物中的抑菌成分對(duì)供試的三種菌均有明顯的抑菌作用，最小的抑菌濃度分別為：副溶血弧菌0.0625 g/ml，創(chuàng)傷弧菌0.03125 g/ml，溶藻弧菌0.03125 g/ml。通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究的抑菌效果，證明，在1mol/L HCl、溶劑的溶解倍數(shù)為20倍、超聲波提取時(shí)間為20min 和頻率240W的提取工藝條件下、在0-1g/ml 五倍子提取物的范圍內(nèi)，1 g/ml五倍子酸提取物對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌的抑菌效果均為最佳。

本文初步考察了五倍子鹽酸提取物的提取工藝及其抑菌效果，而對(duì)于提取五倍子有效成分的最佳溶解劑（如水、醇等）還未得到確認(rèn)，因此，下一步工作將對(duì)提取五倍子有效成分的溶解劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，并對(duì)比出最佳溶解劑，以期五倍子提取物能夠發(fā)揮更好的抑菌效果。

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