呂濤 劉立鵬 李偉杰 欒榮華 趙志敬 胡濤 陶凌 瞿發(fā)林 郭文怡

710032 西安，空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心血管內(nèi)科(呂濤、劉立鵬、李偉杰、欒榮華、趙志敬、胡濤、陶凌、郭文怡)；848000 和田，93926部隊醫(yī)院心血管內(nèi)科(瞿發(fā)林)

高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病和吸煙等心血管危險因素可增加血管內(nèi)皮細胞活性氧(氧化應激的主要成份)的產(chǎn)生，從而促進脂蛋白氧化修飾、內(nèi)皮細胞活化等過程[1]，因此氧化應激在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。已有研究表明，雙鏈端粒序列中的長重復堿基(包括G堿基三聯(lián)體——主要位于端粒)是氧化應激的最好靶目標，因此氧化應激增加了端粒縮短的速率[2]。國外已有研究探討白細胞端粒長度與心血管危險因素的關系，但結(jié)論不一致[3-4]，考慮與種族差異有關[5]。本研究擬在中國人群中初步探討外周血白細胞端粒長度與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)嚴重程度和心血管危險因素的關系，為進一步研究動脈粥樣硬化機制提供參考依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究為單中心開放式橫斷面研究。連續(xù)入選2014年12月至2017年1月在空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內(nèi)科住院的患者231例，其中男性170例，年齡31～87歲，平均(58.7±10.4)歲，均接受選擇性冠狀動脈造影檢查，并接受外周血白細胞端粒長度檢測。

AMI組患者114例，符合AMI的診斷標準[6]；對照組患者117例，經(jīng)冠狀動脈造影檢查發(fā)現(xiàn)三支血管狹窄程度均<50%。排除標準：惡性腫瘤病史；終末期腎臟疾病或肝功能衰竭；1個月內(nèi)有輸血史；骨髓移植術史；感染性疾?。唤Y(jié)締組織??；免疫系統(tǒng)疾病；不接受外周血白細胞端粒長度檢測。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院倫理委員會批準(NCT02500823)，所有入選患者均簽署知情同意書。

分組方法：(1)根據(jù)Gensini評分結(jié)果的四分位數(shù)間距將所有入選患者分為4個亞組：0～5組(61例)、5～27組(56例)、27～71(57例)和71～230(57例)；(2)根據(jù)Framingham危險因素評分將患者分為3個亞組：低危組(<10%)63例、中危組(10%～20%)96例和高危組(>20%)36例。

1.2 臨床基線資料收集

所有入選患者均進行完整的病史采集和資料收集，包括吸煙、高血壓、糖尿病和家族史等病史和總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等生化指標。根據(jù)《中國高血壓防治指南2010》和《中國糖尿病防治指南》分別定義高血壓和糖尿病。根據(jù)相關病史(年齡、性別、吸煙和最高血壓)和生化指標(HDL-C和TC)計算患者的Framingham危險因素評分。

1.3 冠狀動脈狹窄程度評估

所有入選患者均在空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內(nèi)科導管室進行選擇性冠狀動脈造影。造影結(jié)果由與本課題無關的經(jīng)驗豐富的兩名專業(yè)醫(yī)師進行分析。根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果，計算每位患者的Gensini評分(狹窄程度×狹窄部位系數(shù))。

1.4 樣本采集和DNA提取

取所有入選患者冠狀動脈造影前的外周動脈血4 ml裝于5 ml EDTA抗凝管中充分混勻。 采集的血液標本置于離心機中以1 000 r/min離心10 min后去除上清液。將血細胞成份置于1.5 ml離心管中，并凍存于-80℃冰箱。用E.Z.N.A.血液基因組DNA快速提取試劑盒(Omega Bio-Tek，Norcross，GA)提取樣本的基因組DNA。首先利用紅細胞裂解液去除不含DNA的紅細胞；然后通過裂解液裂解白細胞，使DNA游離在溶液中，再通過高鹽沉淀法去除蛋白等雜質(zhì)后獲得用于端粒長度檢測的DNA。

1.5 白細胞端粒長度檢測

采用熒光實時定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)的方法檢測端粒長度。端粒長度=端粒(T)重復拷貝數(shù)/單拷貝基因(S)，即T/S=[2CT(T)/2CT(S)]-1=2-ΔCT[7]。PCR反應液(20 μl)包括10 μl定量PCR預混合溶液-SybrGreen qPCR Master Mix(2×)(BBI)(Roche)(耐熱DNA聚合酶，SYBR Green Ⅰ染料，dNTP混合物，Mg2+)，7.2 μl重蒸水，0.8 μl引物序列和2 μl DNA模版。T反應引物：正向引物：5′-ACACTAAGGTTTGGGTT TGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3′，反向引物：5′-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCC CTAACA-3′；S反應引物：正向引物：5′-GTGCACC TGACTCCTGAGGAGA-3′，反向引物：5′-CCTTGATAC CAACCTGCCCAG-3′。PCR的熱循環(huán)條件為3 min 95℃(7 s 95℃變性、10 s 57℃復性、15 s 72℃延長)共45個周期。在完成上述步驟后，把加好樣品的96/384孔板放在LightCycler480 Software Setup(Roche羅氏)中進行反應。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 臨床基線資料比較

兩組患者臨床基線資料比較，性別、吸煙、糖尿病、HDL-C水平、血鉀和心肌損傷標志物的差異有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，見表1。

表1 AMI組與對照組患者臨床基線資料比較

2.2 白細胞端粒長度比較

AMI患者與對照組患者外周血白細胞端粒長度比較，差異有統(tǒng)計學意義(非參數(shù)檢驗Mann-WhitneyU檢驗，組間P<0.05)，見圖1。亞組分析顯示，AMI與對照組患者白細胞端粒長度在高齡(>59歲)、男性、非高血壓、收縮壓≤150 mmHg、LDL-C≤2.1 mmol/L以及Framingham危險因素評分中危組中存在差異，具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，見表2。

2.3 白細胞端粒長度與Gensini評分的關系

根據(jù)Gensini評分的四分位數(shù)間距將研究對象分為4組，見表3。采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗分析顯示，4組間外周血白細胞端粒長度差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.93，P<0.05)，見圖2。采用Spearman相關分析外周血白細胞端粒長度與Gensini評分的關系，顯示二者呈負相關(r=-0.175，P<0.01)，見圖3。

2.4 白細胞端粒長度與心血管危險因素的關系

表2 AMI組和對照組白細胞端粒長度差異

表3 Gensini評分不同組間白細胞端粒長度比較[M(Q25，Q75)]

圖1 AMI組與對照組患者白細胞端粒長度比較

圖2 Gensini評分組間白細胞端粒長度比較

圖3 白細胞端粒長度與Gensini評分的關系

在AMI患者或?qū)φ战M患者中，未來10年發(fā)生心臟病風險不同組間的白細胞端粒長度差異無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，見表2。采用Spearman相關分析外周血白細胞端粒長度與心血管危險因素的關系，結(jié)果顯示白細胞端粒長度與收縮壓(r=0.14，P=0.04)和HDL-C(r=0.16，P=0.03)相關，與其他心血管危險因素均無相關性(均為P>0.05)，見表4。

3 討論

表4 白細胞端粒長度與心血管危險因素的關系

端粒的作用是維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復制的完整性。DNA分子每分裂復制一次，端粒就縮短一點(約50 kb)，一旦端粒消耗殆盡，細胞將會立即激活凋亡機制，即細胞走向凋亡。所以端粒長度可以作為心血管衰老過程中的重要標志物[8]。大量基礎和臨床研究已經(jīng)證明，氧化應激可以縮短端粒[9]。正常情況下，端粒以一定的速率縮短，當體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平增加，超過了端粒的保護因素(shelterin蛋白復合體[10]等)，將增加端?？s短的速率。

動脈粥樣硬化的病理生理機制至今尚未明確，氧化應激損傷血管內(nèi)皮細胞是動脈粥樣硬化發(fā)生和演變的重要環(huán)節(jié)。在血管壁，ROS——氧化應激的主要成分由幾種酶系產(chǎn)生，包括NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和線粒體電子傳遞鏈；另一方面，體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和對氧磷酶)被激活清除ROS。然而，當過量的ROS產(chǎn)生超過了抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力時，導致氧化應激，而氧化應激可以促進脂蛋白氧化修飾、內(nèi)皮細胞活化和巨噬細胞浸潤激活等動脈粥樣硬化形成過程，這就是氧化應激導致動脈粥樣硬化的主要機制[1]。ROS損傷血管內(nèi)皮細胞，增加血管內(nèi)皮細胞中的端?？s短速率。

Nzietchueng等[11]采用橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，無動脈粥樣硬化的動脈比動脈粥樣硬化相應動脈端粒更長(P<0.05)。以往研究顯示，外周血白細胞端粒長度與血管壁組織中的端粒長度顯著相關(r=0.62，P<0.001)[12]，所以本研究選擇外周血白細胞端粒長度替代血管壁組織中的端粒長度探討端粒長度與冠狀動脈粥樣硬化的關系。而測量外周血白細胞端粒長度更容易應用于臨床檢測，且創(chuàng)傷小。

以往關于端粒長度與心血管疾病的研究大多集中于端粒長度與冠心病的關系，因AMI的高致死率特征，本研究探討端粒長度與AMI的關系。盡管已有國外研究探討了端粒長度與AMI的關系[13]，但其并未闡明端粒長度與AMI嚴重程度的關系，況且端粒長度本身存在種族差異[5]，所以本研究主要探討在中國漢族人群中端粒長度與AMI嚴重程度的關系。

所有的心血管危險因素都能增強氧化應激并誘導eNOS在血管壁中的解耦聯(lián)。eNOS的解耦聯(lián)不僅導致內(nèi)皮NO產(chǎn)生減少，而且還可以進一步促進血管壁中的氧化應激，從而增加端粒縮短的速度[14]。國外已有臨床試驗探討了端粒長度與心血管危險因素的關系，但結(jié)論不一致。Valdes等[3]在白人女性人群中發(fā)現(xiàn)端粒長度與年齡、肥胖、吸煙均有關系，而Neuner等[4]在德國獻血人群中并未發(fā)現(xiàn)與心血管危險因素的關系。本研究采用Framingham評分綜合評估心血管危險因素，并通過相關分析發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中端粒長度與心血管危險因素無顯著相關性。

外周血白細胞端粒長度或可作為一種有力的預測因子來評估AMI的嚴重程度，為進一步研究動脈粥樣硬化機制提供參考依據(jù)。由于本研究樣本量較少，且為單中心研究，入選研究對象過程中可能存在因疾病嚴重程度而造成的選擇偏倚，后續(xù)研究將擴大樣本量、增加研究中心數(shù)量和對入選患者進行長期隨訪以減少偏倚。

利益沖突：無

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