張華，高偉忠（.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州遵義563003；.遵義市第一人民醫(yī)院麻醉科，貴州 563000）

缺血再灌注損傷（IR）是由JENNINGS于1960年首次提出，指組織、器官缺血后再灌注，不僅不能使組織器官功能恢復(fù)，反而因凋亡因子、炎癥介質(zhì)的釋放及自由基的作用等多種因素加重其結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙。肝IR是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，而缺血預(yù)處理是抗IR的有效措施[1]。

紅景天主要活性成分為紅景天苷，研究表明，紅景天苷具有抗疲勞、抗缺氧、抗纖維化等藥理作用[2-5]。但對(duì)肝IR的影響機(jī)制尚不完善。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠肝缺血再灌注模型，分別采用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，探討紅景天苷對(duì)肝缺血再灌注肝細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及動(dòng)物 兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Bax多克隆抗體、總蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TUNEL試劑盒（德國(guó)ROCHE）；Olympus全自動(dòng)生化分析儀；紅景天苷粉劑（昆明同持生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 將56只SD大鼠分為肝缺血再灌注組（IR 組，n=24）、紅景天苷組（S組，n=24）及假手術(shù)組（C組，n=8），參照Pringle法[6]建立模型。IR組及 S組按再灌注1、3、6 h分為3個(gè)亞組。IR組采用夾閉肝蒂全肝缺血30 min，再灌注的方法建立大鼠肝缺血再灌注模型；S組大鼠分別于夾閉前24、48、72 h腹腔注射紅景天苷溶液，劑量40 mg/kg（8 g/L）；C組僅暴露肝蒂，不阻斷肝臟血流。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血，所取大鼠肝組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作切片，部分肝組織-80℃冰箱保存。

1.2.2 大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè) 生化分析儀檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性。

1.2.3 大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)測(cè)定 采用二步免疫組織化學(xué)染色法（PV法）觀察Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果判定：Bcl-2、Bax蛋白光鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或黃褐色顆粒為陽性染色，每個(gè)標(biāo)本在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察15個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞所占視野的百分比（陽性面積積分），進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)大鼠肝組織凋亡表達(dá) 4%多聚甲醛固定肝組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用TUNEL方法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡，具體步驟參照產(chǎn)品說明書，每張切片取5個(gè)視野，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)（陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性細(xì)胞核呈紅色），計(jì)算平均100個(gè)肝細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（AI）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST活性比較 IR組大鼠血清ALT、AST水平在再灌注后1 h開始上升，3 h左右升高最明顯，隨著時(shí)間延長(zhǎng)各指標(biāo)值逐漸下降，但均高于S組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。S組與IR組同一時(shí)間比較，ALT、AST指標(biāo)值均有所下降，但2組均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清 ALT、AST活性比較（±s，U/L）

表1 各組大鼠血清 ALT、AST活性比較（±s，U/L）

注：與C組比較，aP＜0.05；與IR組同時(shí)間比較，bP＜0.05

?

2.2 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況比較 與C組比較，IR、S組肝組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與IR組比較，S組Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bax蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2，圖1、2。

表2 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表2 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況比較（±s）

注：與C組比較，aP＜0.05；與IR組同時(shí)間比較，bP＜0.05

?

圖1 肝組織Bcl-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（200×）

圖2 肝組織Bax免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（200×）

2.3 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡情況比較 IR組、S組肝細(xì)胞凋亡增加，與C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且再灌注3 h后2組肝細(xì)胞凋亡最明顯。與IR組比較，S組肝細(xì)胞凋亡明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖3。

表3 各組大鼠肝細(xì)胞AI比較（±s）

表3 各組大鼠肝細(xì)胞AI比較（±s）

注：與C組比較，aP＜0.05；與IR組同時(shí)間比較，bP＜0.05

?

圖3 肝組織細(xì)胞凋亡結(jié)果（200×）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)參照Pringle法建立肝IR模型，TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注1 h肝細(xì)胞出現(xiàn)少量凋亡，隨著時(shí)間推移，在肝缺血再灌注3 h時(shí)肝細(xì)胞凋亡最明顯。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞基因調(diào)控的一種程序性主動(dòng)自殺式行為，是保持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的基本過程，但是凋亡過度則會(huì)引起組織細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致臟器組織功能障礙。在機(jī)體細(xì)胞凋亡過程中，凋亡調(diào)控基因發(fā)揮不同作用，共分為3類，抑制細(xì)胞凋亡的基因，包括Bcl-2、突變型p53等；促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，包括Bax、野生型p53、C-myc等；在細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)的基因，包括p53、cyclin-D、HSP-70 等[7]。在肝臟缺血再灌注發(fā)生、發(fā)展過程中，大量氧自由基生成造成細(xì)胞線粒體水腫誘發(fā)細(xì)胞凋亡。在線粒體調(diào)控細(xì)胞凋亡的體系中，Bcl-2家族成員構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族與凋亡關(guān)系最密切的基因。Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其位于細(xì)胞線粒體膜上，隨著Bax過度表達(dá)，組織細(xì)胞凋亡可能與細(xì)胞活性氧簇的增加及細(xì)胞線粒體膜電位丟失有關(guān)[8]。Bcl-2與Bax作用相反，其位于細(xì)胞線粒體外膜上，Bcl-2蛋白同源二聚體通過減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載、阻止線粒體PT孔的開放等發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[9]。研究報(bào)道，Bax/Bcl-2蛋白還可通過改變線粒體膜的通透性，抑制caspase-3的激活來抑制細(xì)胞凋亡[10]。

近年研究表明，紅景天苷對(duì)缺血再灌注臟器損傷具有一定的保護(hù)作用[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中，肝缺血再灌注后血清ALT、AST水平升高，經(jīng)紅景天苷預(yù)處理后，血清ALT、AST水平均明顯下降。在缺血再灌注1 h時(shí)肝細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，在3 h時(shí)肝細(xì)胞凋亡達(dá)到峰值，紅景天苷預(yù)處理肝細(xì)胞凋亡明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明紅景天苷可顯著減少肝細(xì)胞凋亡，對(duì)肝IR有保護(hù)作用，同時(shí)，S組較IR組Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)下降，說明紅景天苷對(duì)肝IR的保護(hù)作用可能通過上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax表達(dá)，改變Bcl-2、Bax基因表達(dá)及蛋白表達(dá)，從而減少肝細(xì)胞凋亡。

綜上所述，紅景天苷對(duì)肝IR具有保護(hù)作用，該作用與Bcl-2/Bax基因調(diào)控細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，但是紅景天苷對(duì)其保護(hù)作用還可能存在其他機(jī)制，有待深入探討。

[1]RüDIGER HA，KANG KJ，SINDRAM D，et al.Comparison of ischemic preconditioning and intermittent and continuous inflow occlusion in the murine liver[J].Ann Surg，2002，235（3）：400-407.

[2]劉東璞，盧鳳美，王明富，等.紅景天對(duì)大鼠肝纖維化肝臟組織中TIMP-1、Smad4 表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32（12）：2556-2558.

[3]石路，張延猛，李洋洋，等.紅景天對(duì)高原缺氧環(huán)境下人體運(yùn)動(dòng)前后血流動(dòng)力學(xué)的作用[J].西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（7）：159-456.

[4]榮黎，戴立罩，曾維政.紅景天甙對(duì)擬高原缺氧大鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（31）：5813-5817.

[5]陳亞東，曹秀蘭，田長(zhǎng)有，等.高山紅景天對(duì)小鼠耐缺氧、抗疲勞及耐低溫作用的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2002，9（3）：157-158.

[6]MAEHARA S，ADACHI E，SHIMADA M，et al.Clinical usefulness of biliary scope for Pringle′s maneuver in laparoscopic hepatectomy[J].J Am Coll Surg，2007，205（6）：816-818.

[7]宋勇.活性氧與細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，1997，1（17）：30-32.

[8]HADDAD JJ.The role of Bax/Bcl-2 and pro-caspase peptides in hypoxia/reperfusion-dependent regulation of MAPK（ERK）：discordant proteomic effect of MAPK（p38）[J].Protein Pept Lett，2007，14（4）：361-371.

[9]祝海洲，詹自力，何衛(wèi)陽，等.地塞米松和川芎嗪對(duì)腎缺血再灌注時(shí)c-Fos、Bcl-2、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2004，20（5）：893-895.

[10]ABOUTALEB N，SHAMSAEI N，RAJABI H，et al.Protection of hippocampal CA1 neurons against ischemia/reperfusion injury by exercise preconditioning via modulation of Bax/Bcl-2 ratio and prevention of caspase-3 activation[J].Basic Clin Neurosci，2016，7（1）：21-29.

[11]廖國(guó)平，鄧芳文，孫德貴，等.紅景天苷對(duì)局灶性缺血-再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及對(duì) Bax、Bcl-2 的影響[J].海峽藥學(xué)，2016，28（4）：33-37.

[12]高琨，胡美琴，祁洪剛，等.紅景天苷對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的預(yù)防保護(hù)時(shí)限[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，38（4）：687-691.