何曉曉，熊枝繁，邱夢君，占靜，陳仁旺，楊盛力

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院)

瑞戈非尼是一種口服多激酶抑制劑，做為新型的小分子靶向藥物，在前期的動物實(shí)驗(yàn)和Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的療效和耐受性[1]。2017年4月27日，經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于經(jīng)過索拉非尼治療但疾病仍出現(xiàn)進(jìn)展的肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)患者。至此，瑞戈非尼開始作為二線治療藥物用于肝癌的治療。生物鐘是生物體內(nèi)在的自主調(diào)節(jié)器，能夠維持機(jī)體每天的睡眠-覺醒、代謝、激素分泌和細(xì)胞周期，以保持機(jī)體適當(dāng)?shù)纳砉?jié)律[2，3]。其在分子水平上受Per1、Per2、Per3、CLOCK、BMAL1、CCry1、Cry2、BMAL1、NPAS2、DEC和CKIε等多個(gè)生物鐘基因調(diào)控[4]。目前研究[5]表明，生物鐘基因的表達(dá)異常在實(shí)質(zhì)性的腹部惡性腫瘤中普遍存在；另有研究[6]證實(shí)，生物鐘基因的突變、缺失以及表達(dá)的異常與肝癌的發(fā)生和發(fā)展均具有密切的相關(guān)性。瑞戈非尼在治療肝癌的同時(shí)是否對生物鐘基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，目前尚無研究。2017年3～4月，我們建立了裸鼠皮下肝癌移植瘤模型，擬在驗(yàn)證瑞戈非尼對肝癌療效的同時(shí)，探討該藥對肝癌組織生物鐘基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，購自中國典型物種保藏中心；清潔級BALB/C-nu系裸鼠，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量14～20 g；RPMI1640培養(yǎng)基、FBS、胰酶購于Hyclone公司；DMSO 購于MP公司；生物鐘基因及內(nèi)參PCR引物由Life公司合成；RNA提取試劑TRIzol和PCR試劑SYBR?Green PCR Master Mix購于Life公司；瑞戈非尼片，由德國Bayer公司(West Haven，CT)生產(chǎn)，40 mg/片，溶解于100% DMSO，藥物終濃度為100 mg/mL。

1.2 模型建立與分組處理 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將其輕輕吹打成均勻的細(xì)胞懸液，用PBS稀釋到1×107/mL。取裸鼠16只，消毒裸鼠皮膚；用1 mL注射器向裸鼠右側(cè)腋窩處皮下注入HepG2細(xì)胞懸液 0.2 mL，觀察接種部位液體吸收及成瘤情況。接種3 d后，在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射部位處，均觸及直徑3～4 mm腫瘤結(jié)節(jié)，致瘤成功率達(dá)到100%。1周后根據(jù)成瘤情況將裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組和對照組分別給予瑞戈非尼20 mg/kg、DMSO 100 μL/20 g灌胃，每天1次，連續(xù)給藥2周。

1.3 裸鼠一般情況及移植瘤生長情況觀察 給藥期間，觀察裸鼠一般情況，每隔2 d測量并計(jì)算腫瘤體積；制出每組裸鼠皮下肝癌移植瘤生長曲線，比較兩組生長速度。游標(biāo)卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的最長徑(a)和最短徑(b)，按公式 V=ab2/2 計(jì)算腫瘤體積。

1.4 肝癌細(xì)胞中生物鐘基因檢測 采用Real-time PCR法。2周后頸椎脫臼法處死裸鼠，切取剝離瘤體，凍存于液氮中備用。取兩組凍存腫瘤組織各100 mg，根據(jù)TRIzol使用說明提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA 濃度和純度。取相同量的mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，根據(jù)SYBR?Green PCR Master Mix(2×)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔?？偡磻?yīng)體系為20 μL：SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 模板1.5 μL，10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL，dd H2O 6.5 μL。以 β-actin 作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt表示基因相對表達(dá)量。生物鐘基因、內(nèi)參基因引物及熔解溫度、產(chǎn)物大小，見表 1。

表1 生物鐘及內(nèi)參基因引物

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠一般情況比較 治療前后，兩組裸鼠存活良好，均未出現(xiàn)死亡。隨著瘤體的增大，裸鼠腋下脂肪逐漸減少，食欲較前下降，出現(xiàn)精神不振、行動遲緩。相較于對照組，實(shí)驗(yàn)組裸鼠精神、行動較前無明顯變化，飲食水量、體質(zhì)量較前均有所下降。

2.2 兩組給藥不同時(shí)點(diǎn)裸鼠皮下肝癌移植瘤生長情況比較 與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組瘤體生長速度緩慢，第3～15天瘤體體積有減小趨勢(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組給藥不同時(shí)點(diǎn)裸鼠皮下肝癌移植瘤生長情況比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組裸鼠裸鼠皮下肝癌移植瘤組織中生物鐘基因表達(dá)比較 與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組裸鼠裸鼠皮下肝癌移植瘤組織中Per2、Per3、Cry1、Cry2基因表達(dá)升高，BMAL1基因表達(dá)下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，Per1、CKIε和CLOCK基因表達(dá)兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 兩組裸鼠裸鼠皮下肝癌移植瘤組織中生物鐘基因表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

HCC是一種全球范圍內(nèi)的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高病死率的特點(diǎn)。研究[7～9]表明，HCC的發(fā)生、發(fā)展與多種生物鐘基因表達(dá)紊亂相關(guān)。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肝癌組織中生物鐘基因Per1、Per2、Per3、CLOCK、BMAL1、Cry1、Cry2和CKIε的mRNA表達(dá)水平均明顯降低[10]。

瑞戈非尼作為一種新型口服多靶點(diǎn)磷酸激酶抑制劑，其靶向作用于血管生成(血管內(nèi)皮生長因子受體1～3、表皮生長因子同源結(jié)構(gòu)域酪氨酸激酶2等)、基質(zhì)相關(guān)受體(血小板衍生生長因子受體β、成纖維細(xì)胞生長因子受體等)和致癌受體酪氨酸激酶(KIT、RET和RAF等)相關(guān)因子[11]。2017年5月6日，瑞戈非尼(拜萬戈)在中國正式上市，被允許作為二線用藥應(yīng)用于索拉非尼治療失敗的中晚期HCC患者，其良好的療效和耐受性在前期的臨床試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證[12]。

既往研究[13]表明，生物鐘基因能影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)控，在DNA損傷反應(yīng)以及化療藥物的治療反應(yīng)中均起到重要作用。因此，瑞戈非尼在治療HCC的過程中是否會影響到腫瘤細(xì)胞生物鐘基因的表達(dá)進(jìn)而對其臨床療效產(chǎn)生影響，是目前亟待研究的一個(gè)重要課題。本實(shí)驗(yàn)將人肝癌HepG2細(xì)胞接種于裸鼠腋窩皮下，成功建立了裸鼠皮下肝癌移植瘤模型，給予瑞戈非尼灌胃治療2周后發(fā)現(xiàn)明顯抑制瘤體的生長。為了驗(yàn)證瑞戈非尼能否影響生物鐘基因的表達(dá)，我們利用Real-time PCR技術(shù)檢測了肝癌細(xì)胞中生物鐘基因Per1-3、CLOCK、BMAL1、CKIε和Cry1-2的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，瑞戈替尼治療后能明顯上調(diào)肝癌組織中Per2、Per3、Cry1和Cry2 mRNA的表達(dá)，并下調(diào)BMAL1 mRNA的表達(dá)水平。

目前多項(xiàng)研究結(jié)果[13～15]均發(fā)現(xiàn), 生物鐘基因Per1～3是一種潛在的抑癌基因，它能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在腫瘤細(xì)胞中普遍呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。有研究[10,16]證實(shí)，Cry1～2基因在腫瘤組織中也呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，生物鐘基因Cry2的突變和缺失能夠增加小鼠肝癌的發(fā)生率。本研究結(jié)果證實(shí)了瑞戈非尼對生物鐘基因表達(dá)的影響，這說明該藥除了能夠阻斷涉及腫瘤生長和進(jìn)展過程中的多種磷酸激酶，達(dá)到治療肝癌的作用外，還有望通過改善生物鐘基因紊亂，上調(diào)潛在抑癌基因Per和Cry的表達(dá)，來抑制腫瘤的生長和疾病進(jìn)展。但是，一項(xiàng)最新研究[17]表明，BMAL1過表達(dá)能夠抑制腫瘤發(fā)生，并且增加對化療藥物的敏感性，因此瑞戈非尼對BMAL1表達(dá)的下調(diào)作用可能會對該藥療效產(chǎn)生負(fù)面影響。為進(jìn)一步明確瑞戈非尼能否通過改變生物鐘基因表達(dá)這一途徑影響其治療HCC的藥理作用，接下來我們將從蛋白水平驗(yàn)證瑞戈非尼治療后生物鐘基因的表達(dá)變化，并進(jìn)一步探討該藥影響肝癌細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)改變的信號通路，以期為該藥的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

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