劉曼，程玉，田煥娜，郝美玲，李春輝

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2承德醫(yī)學(xué)院)

胃癌的發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)均居于前列，亦是我國(guó)最常見的消化系統(tǒng)腫瘤[1，2]，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌高病死率的主要原因之一。研究顯示，Hedgehog(Hh)信號(hào)通路與人類多種腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，Smo是該通路的主要受體，而Gli-1是該通路的主要核轉(zhuǎn)錄因子。在胃癌中Hh通路存在激活，但是有關(guān)Hh通路與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力的研究卻很少。2016年11月～2017年7月，我們以低分化黏液腺胃癌細(xì)胞MGC-803為研究對(duì)象，觀察Hh信號(hào)通路特異性抑制劑環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，以及轉(zhuǎn)移相關(guān)因子基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化，為探討胃癌侵襲轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 MGC-803由承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所饋贈(zèng)；RPMI1640(Gibco公司)；胎牛血清(四季青公司)；胰酶(Gibco公司)；PBS(BI公司)；環(huán)靶胺(Solarbio公司)；Matrigel基質(zhì)膠(BD公司)；鼠抗人Gli-1、β-actin單克隆抗體(OriGene公司)；兔抗人MMP-9多克隆抗體(博士德公司)；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠lgG及羊抗兔lgG(KPL 公司)；TRIzol(Takara公司)；反轉(zhuǎn)及PCR的擴(kuò)增試劑盒(Takara 公司)；Smo、Gli-1、GAPDH引物(Takara公司)；MMP-9引物(生工公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞，3 d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化；去除胰酶后，用含10%血清的培養(yǎng)基終止消化。計(jì)數(shù)后接種于96孔板(5×103/孔)，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜；于第2天上午加入30、40、50 μmol/L的環(huán)靶胺，并設(shè)對(duì)照孔，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入MTT，繼續(xù)孵育4 h；去除上層培養(yǎng)基，每孔各加入200 μL DMSO溶解甲瓚；置于搖床上10 min后，放入酶標(biāo)儀中測(cè)定OD值。重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(OD處理孔-OD對(duì)照孔)/OD對(duì)照孔×100%。

1.2.3 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力觀察 采用Transwell小室侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。將基質(zhì)膠置于冰上，4 ℃冰箱過夜解凍。將Matrigel膠按1∶9稀釋，用預(yù)冷槍頭向其中加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基。將Transwell板置于冰上，吸取80 μL基質(zhì)膠，均勻鋪在小室上室中，靜置10 min后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)12 h后取出Transwell板，吸出未凝固的基質(zhì)膠；加入70 μL無血清培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置30 min；水化基質(zhì)膠，細(xì)胞計(jì)數(shù)。以9×104/孔加入各小室的上室，下室加含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基600 μL，分別將0、40 μmol/L的環(huán)靶胺加入上室中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出小室，甲醇固定細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min；PBS清洗2遍后，用棉簽去除上室表面細(xì)胞，待膜干后在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野照相，并統(tǒng)計(jì)各視野下穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，不鋪設(shè)基質(zhì)膠，且每個(gè)小室接種5×104/孔，其余步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.4 細(xì)胞中Smo、Gli-1、MMP-9基因檢測(cè) 采用qRT-PCR法。將細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，分別加入0、40 μmol/L的環(huán)靶胺培養(yǎng)24 h；提取總RNA，用DEPC溶解。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，并設(shè)定相應(yīng)的程序后進(jìn)行qRT-PCR。Smo上游引物5′-TGCTGCACACACTCACCTCT-AA-3′，下游引物5′-AGGCTTTGTCACTCACTGCTCCTA-3′，產(chǎn)物122 bp；Gli-1上游引物5′-ACACATATGGACCTGGCTTTGGA-3′，下游引物5′-CTGCCCTATGTGAAGCCCTATTTG-3′，產(chǎn)物120 bp；MMP-9上游引物5′-ATGCGTGGAGAGTCGAAATC-3′，下游引物5′-CAA-AGGCGTCGTCAATCAC-3′，產(chǎn)物247 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAATACGCCAGTGGA-3′，產(chǎn)物138 bp。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。待程序結(jié)束后，以2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。用不同批次的cDNA重復(fù)試驗(yàn)3次，并設(shè)置復(fù)孔以減少誤差。

1.2.5 細(xì)胞中Gli-1、MMP-9蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。將細(xì)胞置于6孔板中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)分別加入0、40 μmol/L的環(huán)靶胺培養(yǎng)24 h；去除培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次；向每孔中加入裂解液150 μL，使裂解液覆蓋細(xì)胞，置于冰上30 min；收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物于1.5 mL離心管中，4 ℃下以12 000 r/min 離心 20 min；收集上清入新的EP管中，并進(jìn)行標(biāo)記。取等量蛋白加入加樣孔中進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜后，置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉2 h；將膜置于相應(yīng)的一抗(Gli-1、MMP-9、β-actin，TBS稀釋抗體至工作濃度分別為1∶1 500、1∶500、1∶10 000)中，4 ℃孵育過夜；用TBST洗膜3次，每次10 min；將膜置于相應(yīng)的二抗(TBS稀釋抗體至工作濃度1∶15 000)中，室溫?fù)u床孵育1 h；用TBST洗膜3次，每次10 min。配置ECL發(fā)光液，于暗室進(jìn)行顯影，以目的條帶與內(nèi)參光密度比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。用不同批次蛋白重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 隨著環(huán)靶胺濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用增加(P均<0.05)。選取對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率約為20%的24 h、40 μmol/L作為有效時(shí)間和劑量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 不同濃度環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

注：與30 μmol/L比較，*P<0.05，與40 μmol/L比較，#P<0.05。

2.2 不同濃度環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響 環(huán)靶胺處理胃癌細(xì)胞24 h時(shí)，40 μmol/L處理的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的穿膜細(xì)胞數(shù)均多于0 μmol/L(P均<0.05)。見表2。

表2 不同濃度環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 不同濃度環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞Gli-1、Smo、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 環(huán)靶胺處理胃癌細(xì)胞24 h時(shí)，40 μmol/L處理的細(xì)胞Gli-1、Smo、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于0 μmol/L(P均<0.05)。見表3。

表3 不同濃度環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞Gli-1、Smo、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05。

2.4 不同濃度環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞Gli-1、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 環(huán)靶胺處理胃癌細(xì)胞24 h時(shí)，40 μmol/L處理的細(xì)胞Gli-1、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于0 μmol/L(P均<0.05)。見表4。

表4 不同濃度環(huán)靶胺對(duì)胃癌細(xì)胞Gli-1、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05。

3 討論

Hh信號(hào)通路在胚胎時(shí)期處于激活狀態(tài)，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起著調(diào)控作用。但是，正常成年人組織中Hh信號(hào)通路應(yīng)該處于抑制狀態(tài)[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其異常激活與許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[8]。

Hh信號(hào)通路存在兩種受體，即Ptch和Smo；三種配體，即SHH、DHH、IHH。該通路的主要核轉(zhuǎn)錄因子為Gli1，Gli-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平是反映Hh信號(hào)通路活性的可靠指標(biāo)[9]。而當(dāng)存在配體時(shí)，Ptch與配體結(jié)合，解除對(duì)Smo的抑制作用，使得Gli1從微管上分離，以全長(zhǎng)形式進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[10]。

環(huán)靶胺為Hh信號(hào)通路的特異性抑制劑，能有效降低Smo的表達(dá)水平，抑制Hh信號(hào)通路的激活。臨床試驗(yàn)[11]結(jié)果表明，環(huán)靶胺能夠通過有效抑制Hh信號(hào)通路的激活，促進(jìn)基底細(xì)胞癌患者腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但是對(duì)正常的皮膚細(xì)胞沒有影響，說明其具有安全可靠性，為臨床上治療基底細(xì)胞癌提供了新思路。同時(shí)Berman等[12]體外研究證實(shí)，環(huán)靶胺作用于表達(dá)Ptch mRNA的腸源性腫瘤細(xì)胞，顯著抑制 Hh 信號(hào)通路活性，且存在劑量依賴性，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但是作用于不表達(dá)Ptch mRNA的結(jié)腸癌細(xì)胞沒有效果，說明環(huán)靶胺特定作用于Hh 信號(hào)通路，為其臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

胃癌是以早期癥狀不典型、易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移、病死率高為特點(diǎn)的惡性消化道腫瘤，尤其是低分化胃癌，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)。通過環(huán)靶胺研究Hh信號(hào)通路在低分化黏液腺胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的影響報(bào)道不甚明確。在本實(shí)驗(yàn)中，分別用qRT-PCR及Western blotting檢測(cè)MGC-803細(xì)胞中Hh信號(hào)通路存在激活，且能夠被環(huán)靶胺抑制；同時(shí)，環(huán)靶胺能夠降低MGC-803的侵襲和轉(zhuǎn)移水平，但具體作用機(jī)制尚不清楚。

近年來，在研究癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解細(xì)胞外基質(zhì)的研究受到越來越多的重視。MMPs是一組鋅離子依賴性內(nèi)切水解蛋白酶，在腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵性作用，已有20多個(gè)家族成員。MMP-9是其中的重要成員，能夠降解Ⅳ和Ⅴ型膠原以及細(xì)胞外其他基質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要角色。在研究腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中，發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路的激活與MMPs之間在基底細(xì)胞癌、食管癌、胰腺癌等腫瘤的發(fā)展中存在著相關(guān)性[13～16]，但在胃癌中研究較少，且主要集中于組織學(xué)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)靶胺可以降低MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平，說明環(huán)靶胺可能通過抑制Hh信號(hào)通路，從而降低MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)，降低MGC-803的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。然而，環(huán)靶胺可能會(huì)通過其他途徑來調(diào)節(jié)MGC-803的侵襲和轉(zhuǎn)移，具體的調(diào)節(jié)路徑還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，環(huán)靶胺能通過抑制Hh信號(hào)通路下調(diào)MMP-9表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的侵襲和轉(zhuǎn)移。這為其作為靶向藥物或者協(xié)同治療胃癌藥物提供了理論依據(jù)，為靶向治療胃癌提供了新的思路和新的方案。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[3] Du J, Chen W, Yang L, et al. Disruption of SHH signaling cascade by SBE attenuates lung cancer progression and sensitizes DDP treatment[J]. Sci Rep, 2017,7(1):1899.

[4] Cannonier SA, Sterling JA. The role of hedgehog signaling in tumor induced bone disease[J]. Cancers, 2015,7(3):1658-1683.

[5] Kumar RM, Fuchs B. Hedgehog signaling inhibitors as anti-cancer agents in osteosarcom[J]. Cancers, 2015,7(2):784-794.

[6] Shigemura K, Fujisawa M. Hedgehog signaling and urological cancers[J]. Curr Drug Targets, 2015,16(3):258-271.

[7] Song L, Li ZY, Liu WP, Zhao MR. Crosstalk between Wnt/β-catenin and Hedgehog/Gli signaling pathways in colon cancer and implications for therapy[J]. Cancer Biol Ther, 2015,16(1):1-7.

[8] Szkandera J, Kiesslich T, Haybaeck J, et al. Hedgehog signaling pathway in ovarian cancer[J]. Int J Mol Sci,2013,14(1):1179-1196.

[9] Merchant JL, Ding L. Hedgehog signaling links chronic inflammation to gastric cancer precursor lesions[J]. Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2017,3(2):201-210.

[10] Nusslein-Volhard C, Wieschaus E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila[J]. Nature,1980,287(5758):795-801.

[11] Berking C, Hauschild A, Kolbl O, et al. Basal cell carcinoma-treatments for the commonest skin cancer[J]. Dtsch Arztebl Int, 2014,111(22):389-395.

[12] Berman DM, Karhadkar SS, Maitra A, et al. Widespread requirement for Hedgehog ligand stimulation in growth of digestive tract tumours[J]. Nature, 2003,425(6960):846-851.

[13] Williamson AJ, Doscas ME, Ye J, et al. The sonic hedgehog signaling pathway stimulates anaplastic thyroid cancer cell motility and invasiveness by activating Akt and c-Met[J]. Oncotarget, 2016,7(9):10472-10485.

[14] Wang YH, Sui XM, Sui YN, et al. BRD4 induces cell migration and invasion in HCC cells through MMP-2 and MMP-9 activation mediated by the Sonic hedgehog signaling pathway[J]. Oncol Lett, 2015,10(4):2227-2232.

[15] Hsu YL, Hung JY, Liang YY, et al. S100P interacts with integrin alpha7 and increases cancer cell migration and invasion in lung cancer[J]. Oncotarget, 2015,6:29585-29598.

[16] 左小平,秦治明,王凱斌,等.環(huán)巴胺對(duì)人食管癌EC109細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響及作用機(jī)制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(12):1828-1832.