趙蘭，何林秀，江龍洋，王昕楠，魏敏杰，趙琳

(中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110122)

胃癌是消化道常見惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率在我國各種惡性腫瘤中居首位，嚴(yán)重危害人類健康[2]。胃癌發(fā)病有明顯的地域性差別，在我國的西北與東部沿海地區(qū)其發(fā)病率比南方地區(qū)明顯增高[3]。胃癌好發(fā)年齡在50歲以上，男女發(fā)病率約為2∶1[4]。胃腺癌是胃癌的一種，由胃腺體細(xì)胞惡變而來，其發(fā)生率占胃惡性腫瘤的95%。從分子水平研究胃腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有利于發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)，提供新的治療手段[5]。近年來，胃腺癌預(yù)后的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐一直是研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)[6]，其預(yù)后有關(guān)的標(biāo)記物更是如此。胃腺癌的預(yù)后與胃癌的病理分期、部位、組織類型、生物學(xué)行為以及治療措施等因素有關(guān)[7]。微小RNA(miRNA)可影響腫瘤的發(fā)生、侵襲以及轉(zhuǎn)移等過程，它們可以通過調(diào)控靶基因參與相關(guān)的信號通路，進(jìn)而發(fā)揮與癌基因或是抑癌基因類似的作用[8]。但是，哪些miRNA在胃腺癌組織中存在異常表達(dá)，是否可成為胃腺癌生物標(biāo)記物，目前尚不清楚。2017年4～10月，我們通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫，深入分析miRNA在胃腺癌組織中的差異性表達(dá)，并篩選可作為胃腺癌生物標(biāo)記物的miRNA。

1 材料與方法

1.1 胃腺癌組織中差異表達(dá)miRNA的篩選 組織樣本來源于TCGA(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)，下載并預(yù)處理胃腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)集的miRNA表達(dá)資料，篩選出差異表達(dá)基因(DEGs)，閾值設(shè)為FDR<0.05，差異表達(dá)倍數(shù)(FC)>1或<-1。本次研究包含45份正常組織和446份胃腺癌組織樣本。

1.2 胃腺癌組織中高表達(dá)、預(yù)后差miRNA的篩選 用R語言程序包(edgeR包)繪制出熱圖和火山圖，在安裝Survival包的條件下，利用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，篩選出高表達(dá)與低表達(dá)時生存率差異明顯，并且在高表達(dá)時預(yù)后差的miRNA。

1.3 胃腺癌中高表達(dá)、預(yù)后差miRNA的靶基因預(yù)測與富集分析 ①繪制miRNA維恩圖取交集：利用在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將Targetscan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_71/)和miRDB(http://www.miRdb.org/)網(wǎng)站中得出的靶基因取交集，提高準(zhǔn)確率，縮小范圍。它將生成一個文本輸出，指示每個交集中哪些元素或某個列表是惟一的。 如果列表數(shù)目低于7，它還將以Venn/Euler圖的形式生成圖形。 我們可以選擇對稱(默認(rèn))或非對稱維恩圖，計算最多30個列表的交點(diǎn)。圖形輸出以SVG和PNG格式生成。②miRNA靶基因富集分析：利用在線網(wǎng)站DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(GO)分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌組織中差異表達(dá)miRNA的篩選結(jié)果 利用TCGA數(shù)據(jù)庫在45份正常組織和446份胃腺癌組織樣本中篩選出319個差異表達(dá)miRNA，其中下調(diào)95個、上調(diào)224個。圖1是491個樣本和DEGs雙向分層聚類的結(jié)果，橫坐標(biāo)代表樣本的名稱，縱坐標(biāo)代表發(fā)現(xiàn)的差異miRNA，差異表達(dá)的miRNA以不同顏色劃分，深色表示基因表達(dá)上調(diào)，淺色表示基因表達(dá)下調(diào)。由聚類分析圖(圖2)可見，腫瘤和正常組織形成了明顯的聚類群，層次聚類分析顯示，組內(nèi)數(shù)據(jù)關(guān)系接近，基因表達(dá)存在著明顯不同的聚類，可以很好地區(qū)分正常組織與癌組織這兩組樣本。

2.2 胃腺癌組織中高表達(dá)、預(yù)后差的miRNA篩選結(jié)果 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫得到的224個上調(diào)miRNA中篩選出6種高表達(dá)且與預(yù)后有關(guān)的miRNA(P均<0.05)，即miR-217、miR-216a、miR-200b、miR-1911、miR-675、miR-96。見表1。對以上列表中的miRNA作Kaplan-Meier生存曲線，其中miR-216a、miR-217高表達(dá)者預(yù)后差。綜合P值和生存曲線，在以下分析中，我們主要關(guān)注miR-217進(jìn)行研究。

圖1 DEGs在各樣本中的表達(dá)

圖2 差異基因火山圖

miRNALogFCPmiR?2171．6887650．01821miR?216a1．1071390．03071miR?200b1．6719290．04564miR?19113．0849450．04666miR?6751．9620220．03696miR?961．6719290．03195

2.3 胃腺癌組織中miR-217表達(dá)變化及其靶基因分析結(jié)果 胃腺癌組織中miR-217表達(dá)量為303.2±55.16，高于正常組織中的84.82±13.42(P<0.001)。通過Targetscan網(wǎng)站在線預(yù)測miR-217的下游靶基因，得到449個有效基因；同時在miRDB網(wǎng)站預(yù)測靶基因，得到380個基因；將兩者取交集，得到151個基因。通路富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-217的靶基因與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、大分子代謝和蛋白酶的活性密切相關(guān)(圖3)。

3 討論

在本研究中，利用TCGA數(shù)據(jù)庫一共篩選出了319個差異表達(dá)miRNA，其中下調(diào)95個、上調(diào)224個。在224個上調(diào)miRNA中逐一篩選出6個與預(yù)后有關(guān)，根據(jù)其P值與生存曲線挑選出最具潛在生物標(biāo)記物性質(zhì)的miRNA為miR-217，并針對miR-217進(jìn)行后續(xù)研究，分析miR-217在正常組織與胃腺癌組織中的差異表達(dá)，預(yù)測miR-217的靶基因，并對這些靶基因的功能進(jìn)行富集分析，得到了miR-217的差異靶基因與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期，大分子代謝和蛋白酶的活性密切相關(guān)。

圖3 miR-217靶基因功能的GO和KEGG分析

miRNA是長度為21～25個堿基的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，可通過與mRNA特異性的結(jié)合降解或抑制mRNA的蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)控靶基因的表達(dá)。miR-217可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但研究表明miR-217在不同的惡性腫瘤中所發(fā)揮的功能不一致[9～11]。miR-217能夠靶向K-RAS抑制胰腺癌生長[12]，miR-217還能夠靶向核轉(zhuǎn)錄因子E2F3抑制肝癌轉(zhuǎn)移[13]，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-217具有促癌作用[14]。但是，miR-217在胃腺癌中發(fā)揮的作用還沒有過系統(tǒng)的研究。目前，生物信息學(xué)預(yù)測和計算機(jī)技術(shù)在腫瘤研究的各個方面有了很好的應(yīng)用，包括芯片分析和RNA測序在內(nèi)的高通量分析篩選，讓研究者獲得很多關(guān)于基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，并篩選出在腫瘤檢測和靶向治療方面發(fā)揮作用的新的腫瘤生物標(biāo)記物。

本研究采用生物信息學(xué)方法探討miR-217在胃腺癌中的表達(dá)及其臨床意義，它是以更新穎的方法研究胃腺癌可能的發(fā)病機(jī)制與潛在的預(yù)后標(biāo)記物，不僅補(bǔ)充了我們對胃癌以往發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，還為今后的研究提供了基礎(chǔ)。我們通過利用TCGA中胃腺癌的數(shù)據(jù)集，收集胃腺癌相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，將腫瘤組織與正常組織樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，篩選與胃腺癌發(fā)生相關(guān)的miRNA標(biāo)志物。miR-217在胃腺癌組織中高表達(dá)，且在Kaplan-Meier預(yù)后生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-217高表達(dá)提示預(yù)后差。這提示檢測胃腺癌組織中miR-217的表達(dá)有重要的臨床意義。

細(xì)胞凋亡是指有核細(xì)胞在一定條件下通過啟動其自身內(nèi)部遺傳機(jī)制, 主要通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過程 ，也有人稱之為程序性死亡(PCD)，與Caspase、Bcl-2家族蛋白密切相關(guān)[15]。生物的生長發(fā)育需要對細(xì)胞周期進(jìn)行精確協(xié)調(diào)的時空調(diào)控。近年來,以細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)為中心的細(xì)胞周期分子調(diào)控機(jī)制已經(jīng)確立并取得了很大進(jìn)展，即Cyclin與CDK結(jié)合后通過磷酸化調(diào)節(jié)一系列靶分子,這些下游分子激發(fā)一系列下游事件的貫序發(fā)生,最終導(dǎo)致DNA的復(fù)制和有絲分裂,使細(xì)胞周期嚴(yán)格按照G1、S、G2、M循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-217的差異靶基因與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、大分子代謝、蛋白酶的活性密切相關(guān)，提示miR-217可能通過調(diào)控上述途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是具體分子機(jī)制有待更深入的研究。

綜上所述，與正常組織比較，胃腺癌組織中存在miRNA的差異表達(dá)，一些信號傳導(dǎo)途徑、相互作用分子可能參與胃腺癌的發(fā)生發(fā)展。其中，miR-217是與胃腺癌預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，miR-217表達(dá)越高，患者預(yù)后越差，并與PCD、細(xì)胞周期密切相關(guān)，繼續(xù)對這些差異表達(dá)的基因研究將為胃腺癌的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐提供理論指導(dǎo)。

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