賀雄輝，鄒科見(jiàn)，葉木林，蔡國(guó)豪，周衛(wèi)平

(海南省人民醫(yī)院，?？?71001)

腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性行為的基本特征，是促進(jìn)疾病進(jìn)程、復(fù)發(fā)及死亡的病理基礎(chǔ)，與患者的預(yù)后緊密相關(guān)。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多基因、多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，要明確其中的具體機(jī)制是一項(xiàng)浩大工程。目前認(rèn)為，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜的降解是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM及基底膜的主要酶類，其中MMP-2和MMP-9是其家族中具有代表性的兩種酶。既往研究[2]顯示，二者表達(dá)水平有助于預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后。HGC-27和SGC-7901是兩種惡性程度不同的胃癌細(xì)胞株，前者為未分化胃黏液腺癌，后者為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌[3]。一般腫瘤細(xì)胞分化程度越低，惡性程度越高。2013年4月～2017年2月，我們對(duì)比觀察了HGC-27和SGC-7901細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平及細(xì)胞遷移能力，分析胃癌轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HGC-27和SGC-7901細(xì)胞由海南省人民醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)室保存；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；MMP-2和MMP-9 RT-PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；Metrigel Matrix基質(zhì)凝膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；Bio Coat Matrigel侵襲小室購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胃癌細(xì)胞培養(yǎng) 將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)液中(內(nèi)含10%胎牛血清+青霉素100 U/mL+慶大霉素100 U/mL)，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶按1∶3消化傳代。

1.2.2 胃癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。提取細(xì)胞RNA，電泳檢測(cè)RNA提取質(zhì)量；將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PCR法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA水平。引物序列：內(nèi)參GAPDH上游為5′-TAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′，下游為5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′；MMP-2上游為5′-ATCCCATGATGACATCAA-3′，下游為5′-AGCAGCCCAGCCAGTCTGAT-3′；MMP-9上游為5′-CTTAGATCATTCTTCAGTGCC-3′，下游為5′-GATCCACCTTCTGAGACTTCA-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCT計(jì)算MMP-2、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 胃癌細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell侵襲小室。上、下室間孔徑直徑為8 μm，上鋪Metrigel Matrix基質(zhì)凝膠。在其上室加入100 μL培養(yǎng)液，下室加入600 μL培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清)；取30 μL細(xì)胞懸液加入上室，放入CO2孵箱培養(yǎng)24 h。用甲醇固定，0.2%結(jié)晶紫染色；在顯微鏡下觀察每張濾膜10個(gè)不重復(fù)的視野，計(jì)算每個(gè)視野中穿透Metrigel Matrix基質(zhì)凝膠的細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同胃癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較 HGC-27中的MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于SGC-7901，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 胃癌HGC-27和SGC-7901細(xì)胞中MMP-2、 MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與SGC-7901細(xì)胞比較，*P<0.01。

2.2 不同胃癌細(xì)胞遷移能力比較 HGC-27穿膜細(xì)胞數(shù)為(145.89±12.23)個(gè)，高于SGC-7901的(70.54±2.37)個(gè)(P<0.01)。

2.3 胃癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞遷移能力的關(guān)系 相關(guān)性分析顯示，胃癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)與穿膜細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(r分別為0.675、0.463，P均<0.01)。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的體外增殖能力、運(yùn)動(dòng)能力、同質(zhì)黏附能力、異質(zhì)黏附能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力、血管形成能力、體內(nèi)成瘤能力及軟瓊脂克隆形成能力等是腫瘤的主要惡性表型，其中侵襲轉(zhuǎn)移能力十分重要[4～6]。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程大致為：首先細(xì)胞從母體脫離向基質(zhì)侵入，黏附在基底膜上，經(jīng)過(guò)水解酶的作用，將具有抑制其遷移的基底膜及ECM降解，然后錨定一些繼發(fā)組織或器官，最終形成轉(zhuǎn)移病灶。因此，降解ECM和基底膜是遷移過(guò)程中的重要步驟，以利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散。

MMPs是一類能破壞組織結(jié)構(gòu)及基底膜的蛋白水解酶大家族，迄今為止發(fā)現(xiàn)的相關(guān)酶類不下20種。其中，MMP-2、MMP-9屬于明膠酶類，能夠降解基膜的主要成分Ⅳ型膠原，在機(jī)體炎癥、新生血管形成及腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]，目前已成為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究中的熱點(diǎn)。既往已有多項(xiàng)研究表明二者與腫瘤有關(guān)，包括腫瘤的分級(jí)、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)等。M?kinen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤TNM分期越高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，那么對(duì)應(yīng)的MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平也就越高，提示惡性程度越高的腫瘤MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平越高。HGC-27細(xì)胞株屬于未分化胃黏液腺癌，惡性程度高于SGC-7901。本研究結(jié)果顯示，HGC-27細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA水平明顯高于SGC-7901，與侯曉麗等[9]研究相符，進(jìn)一步證明了腫瘤惡性程度與MMP-2、MMP-9表達(dá)水平呈正相關(guān)。

目前，多數(shù)研究是通過(guò)分析MMP-2、MMP-9表達(dá)與患者臨床病理特征的相關(guān)性來(lái)推測(cè)其與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。馮寧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2 蛋白與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，而 MMP-9蛋白與胃癌的分化及腫瘤浸潤(rùn)有關(guān)；陳友權(quán)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2與MMP-9參與胃癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與趨化因子 SDF-1 及其受體 CXCR4 軸的作用有關(guān)。而本研究通過(guò)Transwell侵襲小室模型檢測(cè)穿膜細(xì)胞數(shù)來(lái)反映其體外侵襲轉(zhuǎn)移能力，客觀性更強(qiáng)；穿膜細(xì)胞數(shù)越多，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)[12，13]。本研究結(jié)果顯示，HGC-27細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)較SGC-7901明顯增多，說(shuō)明HGC-27細(xì)胞的侵襲遷移能力更強(qiáng)。不難理解，高表達(dá)的MMP-2、MMP-9更能降解ECM和基底膜，破壞腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的屏障，從而為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了可能，尤其是惡性程度越高的腫瘤[14，15]。

綜上所述，與SGC-7901細(xì)胞比較，HGC-27細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)更多、侵襲轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，其機(jī)制可能與MMP-2與MMP-9高表達(dá)有關(guān)。這提示通過(guò)抑制MMPs功能或阻斷 MMPs 合成的信號(hào)通路，可成為胃癌治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

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