劉源，王璐，馬超，武聚山

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京100069)

霉素靶蛋白(mTOR)等在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用；P70是PI3K信號通路的下游分子，與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。Prucalopride是一種選擇性、高親和力的5-羥色胺(5-HT)4受體激動劑，可增加腸道巨幅推進(jìn)性收縮(GMC)[3]，對慢性便秘具有較好療效，但對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控研究仍為空白[5,6]。2016年11月～2017年4月，我們觀察了Prucalopride對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細(xì)胞MKN28購自上海中科院細(xì)胞庫；Prucalopride 購自美國MCE公司；PI3K信號通路關(guān)鍵蛋白蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、mTOR、磷酸化mTOR (p-mTOR)、P70一抗均購自美國CST公司；細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、活化的Caspase3(Active Caspase3)、內(nèi)參GAPDH 一抗和HRP標(biāo)記的二抗均購自Proteintech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 將MKN28細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時，種植到6孔板中。待6孔板中的細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，隨機(jī)分為觀察組和對照組，分別予以10 μmol/L的Prucaloprid 及等體積DMSO處理24 h。

1.2.2 細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK8法。將常規(guī)培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞消化計數(shù)，制備細(xì)胞懸液，以1×103/孔接種96孔板；細(xì)胞分組與處理同1.2.1，每隔24 h檢測細(xì)胞活力1次，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm激發(fā)光時的OD值，繪制增殖曲線。

1.2.3 細(xì)胞遷移和侵襲能力觀察 采用Transwell 遷移和侵襲實驗。將Matrigel基質(zhì)膠100 μL(無血清培養(yǎng)液按1∶6稀釋)加入到24孔板的Transwell小室的上室中，培養(yǎng)箱中靜置4～6 h成膠；下室中加無血清培養(yǎng)液，靜置半小時水化基底膜。將兩組加藥處理24 h的細(xì)胞(5×103個)用無血清培養(yǎng)，制備細(xì)胞懸液加入到上室中，下室中加入500 μL完全培養(yǎng)液。過夜后以4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。隨機(jī)選取5個視野，拍照觀察并計數(shù)。遷移實驗步驟同侵襲實驗，Transwell小室無須進(jìn)行鋪膠處理，細(xì)胞數(shù)目為5×103個。以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞遷移和侵襲能力。

1.2.4 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取兩組加藥處理24 h后的細(xì)胞，更換成無血清培養(yǎng)基，常規(guī)條件下培養(yǎng)饑餓24 h。收集細(xì)胞，以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106～5×106/mL。加入Annexin V/FITC 混勻后于室溫避光孵育5 min，加入10 μL染液，上流式細(xì)胞儀檢測，用Flowjo 軟件計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及PI3K信號通路蛋白檢測 采用Western blotting法。取兩組處理24 h的細(xì)胞，提取蛋白，BCA法測定濃度。垂直電泳槽內(nèi)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯影。Quantity One 軟件掃描灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參灰度比值表示各蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡情況比較 兩組處理24 h時細(xì)胞OD值比較無統(tǒng)計學(xué)差異，48、72 h時觀察組細(xì)胞OD值均低于對照組(P均<0.05)，見表1。觀察組細(xì)胞遷移及侵襲個數(shù)分別為(150±6)、(59±2)個，均高于對照組的(58±3)、(21±4)個(P均<0.05)；觀察組細(xì)胞凋亡率為26.1%，高于對照組的3.9%(P<0.05)。

表1 兩組細(xì)胞增殖情況比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及PI3K信號通路蛋白表達(dá)情況比較 與對照組比較，觀察組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax、Active Caspase3及PI3K信號通路蛋白p-AKT、p-mTOR、P70表達(dá)量增加(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及PI3K信號通路蛋白表達(dá)情況比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

5-HT又稱血清素，最早在血清中發(fā)現(xiàn)。5-HT4在哺乳動物中廣泛存在，在神經(jīng)突觸和大腦皮層中含量較高，屬于抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)[7]。而在外周組織中，5-HT是一種強(qiáng)效的平滑肌收縮刺激劑，在胃腸道運動、消化液分泌等功能中發(fā)揮重要作用[8]。 5-HT受體存在十幾種亞型，消化系統(tǒng)中至少有5種受體，其中5-HT4受體與胃腸道運動、消化液分泌最為相關(guān)[9,10]。Prucalopride是一種選擇性高親和力5-HT4受體激動劑，近年來在胃部疾病中的治療作用逐漸被發(fā)掘。在豬胃環(huán)肌中，Prucalopride可以促進(jìn)膽堿能神經(jīng)傳遞[11]。2014年，Broad等[12]發(fā)現(xiàn) Prucalopride在人食管和胃底部可以調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉活動，降低胃食管反流。近期，多個研究報道發(fā)現(xiàn)Prucalopride在健康人和胃腸道疾病患者中具有良好的胃排空作用，但其機(jī)體作用機(jī)制尚待研究[13,14]。然而，在消化系統(tǒng)腫瘤中，Prucalopride的作用尚未見報道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組胃癌細(xì)胞MKN28的增殖、遷移和侵襲能力均受到抑制，且胃癌凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，提示Prucalopride對胃癌的發(fā)展存在一定抑制作用，具有潛在的臨床藥物應(yīng)用價值。為進(jìn)一步闡明Prucalopride對胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制，我們觀察了與腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡功能相關(guān)的信號通路變化，發(fā)現(xiàn)觀察組AKT和mTOR的磷酸化水平受到顯著抑制，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白P70表達(dá)水平降低。AKT和mTOR是PI3K信號通路中的關(guān)鍵因子，廣泛參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等功能調(diào)節(jié)。研究顯示，PI3K通路相關(guān)蛋白在眾多腫瘤中存在表達(dá)量增高或異常持續(xù)性激活，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)；并且持續(xù)激活的AKT可阻止多個凋亡途徑，促進(jìn)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移[15]。因此，我們推測Prucalopride可能通過PI3K通路影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。細(xì)胞經(jīng)Prucalopride處理后，AKT的磷酸化過程受到抑制，mTOR磷酸化亦受抑制，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白P70；同時，通過激活Caspase9等凋亡相關(guān)蛋白，加速Caspase3活化，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase參與真核生物的細(xì)胞凋亡，Caspase9和Caspase3是該家族的重要成員。Caspase9可以被AKT通路激活，進(jìn)而剪切并產(chǎn)生Active Caspase3，引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Prucalopride可以抑制體外胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，通過PI3K信號通路影響腫瘤細(xì)胞功能。已有的研究顯示，Prucalopride在人體疾病治療過程中主要的不良反應(yīng)是消化系統(tǒng)和頭部不適癥狀，如惡心、腹痛、腹瀉、頭痛，程度均為輕到中度，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)，與傳統(tǒng)的腫瘤治療藥物相比有極大的優(yōu)勢。因此，Prucalopride在胃癌治療中具有潛在的應(yīng)用前景，亟待進(jìn)一步的體內(nèi)實驗驗證和開發(fā)。

[1] Ahmedin J, Freddie B, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. Ca Cancer Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] Wang K, Yuen ST, Xu J, et al. Whole-genome sequencing and comprehensive molecular profiling identify new driver mutations in gastric cancer[J]. Nat Genet, 2014,46(6):573-582.

[3] Emmanuel AV, Roy AJ, Nicholls TJ, et al. Prucalopride, a systemic enterokinetic, for the treatment of constipation[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2002,16(7):1347.

[4] Bouras EP, Camilleri M, Burton DD, et al. Prucalopride accelerates gastrointestinal and colonic transit in patients with constipation without a rectal evacuation disorder[J]. Gastroenterology, 2001,120(2):354-360.

[5] Camilleri M, Kerstens R, Rykx A, et al. A placebo-controlled trial of prucalopride for severe chronic constipation[J]. N Engl J Med, 2008,358(22):2344.

[6] Tack J, Van OM, Beyens G, et al. Prucalopride (Resolor) in the treatment of severe chronic constipation in patients dissatisfied with laxatives[J]. Gut, 2009,58(3):357.

[7] Nicholson SL, Brotchie JM. 5-hydroxytryptamine (5-HT, serotonin) and Parkinson's disease -opportunities for novel therapeutics to reduce the problems of levodopa therapy[J]. Eur J Neurol, 2015,9(Suppl 3):1-6.

[8] Yu Y, Wu S, Li J, et al. The effect of curcumin on the brain-gut axis in rat model of irritable bowel syndrome: involvement of 5-HT-dependent signaling[J]. Metab Brain Dis, 2015,30(1):47.

[9] Kei G, Isao K, Hiroyuki I, et al. Activation of 5-HT4 receptors facilitates neurogenesis from transplanted neural stem cells in the anastomotic ileum[J]. J Physiol Sci, 2016,66(1):1-10.

[10] Barnes NM, Sharp T. A review of central 5-HT receptors and their function[J]. Neuropharmacology, 1999,38(8):1083.

[11] Priem E, Van CI, De Maeyer JH, et al. The facilitating effect of prucalopride on cholinergic neurotransmission in pig gastric circular muscle is regulated by phosphodiesterase 4[J]. Neuropharmacology, 2012,62(5-6):2126-2135.

[12] Broad J, Hughes F, Chin-Aleong J, et al. Regionally dependent neuromuscular functions of motilin and 5-HTa receptors in human isolated esophageal body and gastric fundus[J]. Neurogastroenterol Motil, 2014,26(9):1311-1322.

[13] Kessing BF, Smout AJPM, Bennink RJ, et al. Prucalopride decreases esophageal acid exposure and accelerates gastric emptying in healthy subjects[J]. Neurogastroenterol Motil, 2014,26(8):1079.

[14] Carbone F, Rotondo A, Andrews CN, et al. 1077 a controlled cross-over trial shows benefit of prucalopride for symptom control and gastric emptying enhancement in idiopathic gastroparesis[J]. Gastroenterology, 2016,150(4):213-214.

[15] Hemmings BA, Restuccia DF. The PI3K-pKB/Akt pathway[J]. Cold Spring Harb perspect Biol, 2015,7(4):a026609.