牛明福，李亞恒，陳金帥，李陽

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023) 2(洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽，471023) 3(河南科技大學(xué)，微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，河南 洛陽，471023)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)又稱β-苯乙醇，是一種具有柔和而持久玫瑰香氣的芳香醇，廣泛應(yīng)用于日化和食用香精中[1-2]。目前主要采用化學(xué)合成或從天然物中提取獲得該成分。化學(xué)合成2-苯乙醇雖已步入工業(yè)化生產(chǎn)階段，但其產(chǎn)物中存在諸多復(fù)雜且難以除去的副產(chǎn)物，如氯乙醇、鄰氯乙苯、聯(lián)苯等副產(chǎn)物，并伴隨刺激性氣味，嚴(yán)重危害人體健康。許多芳香植物如玫瑰、茉莉、風(fēng)信子等的精油中含有2-苯乙醇，但含量極低，從中提取的2-苯乙醇不僅價格昂貴，且難以滿足市場需求[3-4]。因此，通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然2-苯乙醇得到了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注[5]。

多種酵母具有合成2-苯乙醇的能力，如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiasp.)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)及異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)等[6]，主要通過艾氏途徑(Ehrlich pathway)，將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成2-苯乙醇[7-8]。限制酵母轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇能力的因素有兩方面：一方面是發(fā)酵過程中存在嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制效應(yīng)，這是影響2-苯乙醇產(chǎn)量的主要瓶頸之一[9]；另一方面，為了控制因發(fā)酵產(chǎn)熱造成的溫度上升，需要安裝控溫裝置，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加[10]。因此，篩選2-苯乙醇耐受性能較好且具有耐高溫能力的優(yōu)質(zhì)菌株是實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。在前期研究中，本課題組篩選出1株耐高溫且2-苯乙醇耐受性良好的馬克斯克魯維酵母LY1菌株，其最適生長溫度為37 ℃，在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中發(fā)酵2-苯乙醇的產(chǎn)量為0.96 g/L。馬克斯克魯維酵母是一種具有可利用底物廣泛、生長速率較快等優(yōu)勢的耐高溫酵母[11]。本試驗通過單因素與響應(yīng)面分析，探討主要培養(yǎng)基成分對酵母合成2-苯乙醇的影響，得到較優(yōu)的培養(yǎng)基組成，并研究LY1菌株在高溫條件下的發(fā)酵性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

馬克斯克魯維酵母LY1菌株、釀酒酵母AC菌株：由河南科技大學(xué)微生物基因工程研究室分離鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0，酵母浸粉 10.0，瓊脂粉 20.0，自然pH值。

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0，酵母浸粉 10.0，自然pH值。

基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 60.0，蛋白胨 6.0，MgSO40.5，KH2PO45.0，L-苯丙氨酸 6.0，自然pH值。

1.1.3 主要試劑

L-苯丙氨酸：生工生物公司(上海)股份有限公司，純度98.5%；2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品：生工生物公司(上海)股份有限公司，純度98.0%；甲醇：西隴化工股份有限公司，色譜純。

1.2 主要設(shè)備

恒溫組合式搖床(HYL-C2),太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀(1260 Infiity),美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

將保種管中的酵母菌劃線接入固體YPD培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)48 h。從培養(yǎng)皿挑取1環(huán)單菌落至5 mL種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 2-苯乙醇的轉(zhuǎn)化合成

將種子液按10%接種量接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，28 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.3.3 2-苯乙醇的檢驗方法

采用反相高效液相色譜法測定2-苯乙醇的產(chǎn)量[12]，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，用0.22 μm有機系濾膜過濾。HPLC檢測條件為：Venusil MP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，進樣量10 μL，流動相為(甲醇)∶(水)=6∶4，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長260 nm，檢測時間12 min。

1.3.4 單因素試驗

以2-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo)，分別考察轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基主要成分對2-苯乙醇合成的影響，包括L-苯丙氨酸添加量、碳源種類及添加量、氮源種類及添加量[13]。各項添加水平如下：

L-苯丙氨酸：0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L；

不同種類碳源：葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、菊粉、乳糖、甘油均為60.0 g/L；

碳源：20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 g/L；

不同種類氮源：酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨均為6.0 g/L；

氮源：0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取3個自變量，以2-苯乙醇產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計方法對培養(yǎng)基成分進行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，利用Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)處理和回歸分析[14]。

1.3.6 耐受性試驗

用無菌水將種子液稀釋，吸取200 μL均勻涂布于含不同質(zhì)量濃度2-苯乙醇(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L)的固體培養(yǎng)基上，分別置于28、36、42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，計算長出的酵母菌落數(shù)。

1.3.7 高溫發(fā)酵試驗

將種子液接種到優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，分別在28、30、32、34、36、38、40、42 ℃條件下進行發(fā)酵，測定發(fā)酵液中2-苯乙醇的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1L-苯丙氨酸添加量對2-苯乙醇合成的影響

艾氏途徑中，L-苯丙氨酸作為底物參與2-苯乙醇的合成。L-苯丙氨酸添加量對2-苯乙醇合成的影響如圖1所示，當(dāng)L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度范圍在0～6 g/L時，2-苯乙醇產(chǎn)量增加幅度較大，L-苯丙氨酸添加量超過8.0 g/L時，2-苯乙醇產(chǎn)量基本穩(wěn)定，但底物質(zhì)量濃度的增加會使轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢[15]，造成原料利用率降低。因此，L-苯丙氨酸最佳添加量應(yīng)為8 g/L。

圖1 L-苯丙氨酸添加量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.1 Effects of L-Phe dosage on 2-PE production

2.1.2 碳源種類對2-苯乙醇合成的影響

馬克斯克魯維酵母可以產(chǎn)生菊粉酶、乳糖酶等水解酶，與其他酵母相比可利用的底物較廣泛[16]。碳源種類對2-苯乙醇合成的影響如圖2所示，LY1菌株能夠較好地利用葡萄糖和蔗糖作為碳源，以供生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇，亦能利用菊粉，但以麥芽糖、乳糖、甘油作為碳源的2-苯乙醇產(chǎn)量較低。因此，選擇產(chǎn)量最高且成本較低的蔗糖作為碳源進行后續(xù)試驗。

圖2 不同碳源對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.2 Effects of carbon sources on 2-PE production

2.1.3 碳源添加量對2-苯乙醇合成的影響

以蔗糖作為碳源，考察不同添加量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響，結(jié)果見圖3。蔗糖質(zhì)量濃度在20.0～40.0 g/L范圍內(nèi)時，隨著蔗糖添加量的增加，2-苯乙醇產(chǎn)量顯著提高。但隨著蔗糖的繼續(xù)添加，2-苯乙醇產(chǎn)量呈下降趨勢，說明在高糖環(huán)境下，酵母細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的差異影響了菌體的正常生長，導(dǎo)致2-苯乙醇產(chǎn)量下降。因此，確定蔗糖的最佳添加量是40.0 g/L。

圖3 蔗糖添加量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.3 Effect of sucrose dosage on 2-PE production

2.1.4 氮源種類對2-苯乙醇合成的影響

氮源分為有機氮和無機氮，選擇酵母浸粉、蛋白胨、尿素、(NH4)2SO44種常用氮源[17]，分別考察添加不同氮源和不添加氮源(僅以L-苯丙氨酸作為唯一氮源)對LY1菌株轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同氮源對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on 2-PE production

酵母浸粉或蛋白胨作為氮源以供酵母利用時，轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的效果高于尿素和(NH4)2SO4，說明LY1菌株利用有機氮的能力高于無機氮。當(dāng)L-苯丙氨酸作為唯一氮源時，2-苯乙醇轉(zhuǎn)化效果并不理想，是因為L-苯丙氨酸作為氮源不能滿足酵母正常生長需求，導(dǎo)致菌體活性不高，轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的能力也隨之下降。因此，選擇酵母浸粉作為轉(zhuǎn)化氮源以供后續(xù)試驗。

2.1.5 氮源添加量對2-苯乙醇合成的影響

以酵母浸粉為氮源，考察氮源添加量對2-苯乙醇合成的影響，結(jié)果見圖5。隨著酵母浸粉添加量的增加，2-苯乙醇產(chǎn)量呈上升趨勢，當(dāng)酵母浸粉質(zhì)量濃度超過6.0 g/L時，2-苯乙醇產(chǎn)量略有下降。說明添加適量的氮源有利于2-苯乙醇的合成，氮源過量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的效果并不明顯。當(dāng)培養(yǎng)基中酵母浸粉質(zhì)量濃度超過10.0 g/L時，高效液相色譜的結(jié)果會受到酵母浸粉的影響，無法檢測2-苯乙醇產(chǎn)量。因此，確定酵母浸粉的最佳添加量是6.0 g/L。

圖5 酵母浸粉添加量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.5 Effect of yeast extracts dosage on 2-PE production

2.2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果，選取L-苯丙氨酸添加量(A)、蔗糖添加量(B)、酵母浸粉添加量(C)作為3個自變量，以2-苯乙醇產(chǎn)量作為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，考察3種培養(yǎng)基成分與2-苯乙醇合成之間的關(guān)系。試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表1。

對表1中的數(shù)據(jù)進行逐步回歸擬合，得到如下回歸方程：Y=1.44+3.125E-003A+0.018B+0.054C+2.000E-003AB-7.500E-004AC-2.500E-003BC-8.125E-003A2-0.054B2-0.079C2，其響應(yīng)值與自變量之間呈線性關(guān)系且較為顯著(P>F=0.000 1，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.989 6)，該方程可用于分析和預(yù)測2-苯乙醇的產(chǎn)量。

根據(jù)回歸方程得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：L-苯丙氨酸8.39 g/L，蔗糖43.25 g/L，酵母浸粉6.68 g/L，預(yù)測2-苯乙醇的產(chǎn)量為1.448 g/L。為證實預(yù)測結(jié)果，用以上配方重復(fù)試驗3次，得2-苯乙醇平均產(chǎn)量為1.450 g/L，實驗值與預(yù)測值擬合性良好。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 1 Experimental design and correspondingresponse value

2.3 因素間的交互影響

對響應(yīng)面試驗進行方差分析，回歸方程的交互項中只有BC項顯著(p=0.047 3)，其余交互項均不顯著。說明蔗糖與酵母浸粉添加量對2-苯乙醇合成的影響顯著，而L-苯丙氨酸添加量對其影響不顯著。響應(yīng)面回歸方程擬合繪制響應(yīng)面圖形，如圖6。

圖6 蔗糖與酵母浸粉影響2-苯乙醇產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour of the effect on 2-PE production by saccharose and yeast extracts

圖6-a是以蔗糖與酵母浸粉添加量為變量生成的響應(yīng)面圖，兩者添加量的增加均會使2-苯乙醇產(chǎn)量增大，過量的蔗糖與酵母浸粉不利于2-苯乙醇的生物合成。圖6-b中等高線的形狀可以反映交互效應(yīng)的強弱，等高線圖成橢圓形，說明兩因素之間交互作用顯著，對2-苯乙醇合成的影響較大。

2.4 耐受性試驗結(jié)果

一般酵母菌的最適生長溫度在28 ℃左右，而馬克斯克魯維酵母是一種耐高溫酵母，可以在42 ℃的高溫條件下進行發(fā)酵。將酵母菌涂布于含有不同質(zhì)量濃度2-苯乙醇的固體培養(yǎng)基中，在28～42 ℃培養(yǎng)，考察高溫對酵母細(xì)胞耐受2-苯乙醇的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 不同溫度下2-苯乙醇耐受性結(jié)果Table 2 The tolerance of 2-PE under different temperatures

注：+表示生長狀況；-表示征耐受極限；×表示完全不生長。

當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時，馬克斯克魯維酵母LY1菌株和釀酒酵母AC菌株的最高2-苯乙醇耐受質(zhì)量濃度均為2.5 g/L。2-苯乙醇添加量過高會抑制酵母的生長繁殖[18]，隨著培養(yǎng)溫度升高和2-苯乙醇質(zhì)量濃度的增加，酵母菌落數(shù)不斷減少表明：高溫和2-苯乙醇的聯(lián)合脅迫作用導(dǎo)致LY1菌株的2-苯乙醇耐受能力降低，37 ℃時的耐受質(zhì)量濃度為2.0 g/L，且42 ℃時的耐受質(zhì)量濃度仍為1.5 g/L。然而，釀酒酵母AC菌株的耐受能力較差，42 ℃時僅高溫脅迫已完全抑制其正常生長，在37 ℃時雖能正常生長但2-苯乙醇耐受質(zhì)量濃度幾乎為0 g/L。說明馬克斯克魯維酵母具有較強的高溫和2-苯乙醇耐受能力，且具有很大的高溫發(fā)酵2-苯乙醇的潛力。

2.5 高溫發(fā)酵試驗結(jié)果

將種子液接種到上述優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在28～42 ℃溫度范圍內(nèi)進行發(fā)酵，考察高溫對LY1菌株轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響，確定最適發(fā)酵溫度，結(jié)果如圖7所示。發(fā)酵溫度在28～32 ℃范圍內(nèi)時，2-苯乙醇產(chǎn)量較高且穩(wěn)定，說明LY1菌株轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的最佳溫度范圍在28～32 ℃。隨著溫度的繼續(xù)上升，2-苯乙醇產(chǎn)量逐漸下降，在42 ℃時，2-苯乙醇產(chǎn)量為0.809 g/L，說明LY1菌株高溫發(fā)酵能力較強，在42 ℃高溫環(huán)境下仍具有一定轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的能力。

圖7 發(fā)酵溫度對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on 2-PE production

目前，國內(nèi)外有關(guān)溫度對酵母轉(zhuǎn)化2-苯乙醇影響的報道較少。黃筱萍等[15]研究了不同轉(zhuǎn)化溫度對釀酒酵母SH003合成2-苯乙醇的影響，其最適轉(zhuǎn)化溫度為28～30 ℃，低于26 ℃和高于32 ℃產(chǎn)物濃度明顯下降。明紅梅等[19]研究了溫度對傳統(tǒng)濃香型大曲中分離篩選的異常威克漢姆酵母菌株J7發(fā)酵生產(chǎn)2-苯乙醇的影響，發(fā)現(xiàn)在33 ℃下發(fā)酵時，2-苯乙醇產(chǎn)量最高，并采用響應(yīng)面法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時，2-苯乙醇產(chǎn)量為63.50 mg/kg。通常酵母菌轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的發(fā)酵溫度為28～30 ℃，而耐高溫酵母可以在35 ℃以上合成2-苯乙醇。ETSCHMANN等[20]篩選出的耐熱性馬克斯克魯維酵母CBS600菌株在35 ℃條件下，在以糖蜜為碳源的合成培養(yǎng)基中發(fā)酵41 h后，2-苯乙醇終產(chǎn)量達到0.89 g/L。ESHKOL等[21]從耐熱釀酒酵母菌株Ye9系列中篩選到了1株能夠耐受2.5 g/L以上2-苯乙醇的Ye9-612，30 ℃發(fā)酵72 h后，產(chǎn)量達到0.85 g/L。LY1菌株與其他耐高溫菌株相比，在35 ℃以上高溫條件下具有更強的2-苯乙醇發(fā)酵能力。LY1菌株的最適生長溫度為37 ℃，而其2-苯乙醇的最適轉(zhuǎn)化溫度低于最適生長溫度可能與2-苯乙醇合成的相關(guān)酶的活性及穩(wěn)定性有關(guān)[19]。對比耐受性試驗結(jié)果，LY1菌株在36 ℃時的2-苯乙醇產(chǎn)量遠(yuǎn)低于耐受極限，其高溫發(fā)酵2-苯乙醇的產(chǎn)量仍具有較大的提升空間。

3 結(jié)論

微生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇具有成本低、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點，已受到廣泛關(guān)注。如何提高微生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的產(chǎn)量是近年來的研究重點之一。發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件能很大程度上影響酵母細(xì)胞生產(chǎn)2-苯乙醇的產(chǎn)量。本研究通過單因素試驗篩選出合適的轉(zhuǎn)化碳源和氮源，并對主要培養(yǎng)基成分的添加量進行響應(yīng)面分析，優(yōu)化后的結(jié)果為：L-苯丙氨酸8.39 g/L，蔗糖43.25 g/L，酵母浸粉6.68 g/L。在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，2-苯乙醇產(chǎn)量可達到1.450 g/L，較優(yōu)化前提高了51.0 %。與其他耐高溫菌株相比，LY1菌株在35 ℃以上具有更強的2-苯乙醇發(fā)酵能力，且在42 ℃高溫條件下仍具有一定的2-苯乙醇耐受和發(fā)酵能力，后續(xù)研究可從基因改造方向入手[22]，提高其高溫和2-苯乙醇耐受性能，進一步提高轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的能力。

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