魏 娜，張 萍，于 莉，徐建江

骨折愈合是指骨折、截骨、關(guān)節(jié)融合和骨移植術(shù)后的自然骨連接的過(guò)程。其最終結(jié)局是損傷的骨組織恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)功能，涉及到多種細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與鈣化等修復(fù)過(guò)程。骨折愈合有“一期愈合”及“二期愈合”兩種形式。一期愈合是指在完全解剖復(fù)位和絕對(duì)固定的條件下，骨折斷端之間發(fā)生直接愈合；而二期愈合則是在非絕對(duì)固定的情況下的間接愈合。骨折二期愈合以骨痂生長(zhǎng)橋愈合為主，是臨床常見并一直推崇的骨折愈合方式，主要包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩種，膜內(nèi)成骨的機(jī)制為骨化部位的間充質(zhì)干細(xì)胞直接分化為成骨細(xì)胞，常見于顱頂骨和面顱諸骨以及鎖骨。軟骨內(nèi)成骨是先由間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞終末分化和凋亡，骨基質(zhì)鈣化，再以鈣化的骨基質(zhì)為模板開始延伸完成骨化過(guò)程，主要發(fā)生在長(zhǎng)骨、短骨及部分不規(guī)則骨中。骨組織的再生能力較強(qiáng)，骨折后，在骨折處先形成肉芽組織，然后出現(xiàn)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞，形成新生的骨小梁，連接填充于斷端之間，稱為骨痂。此后幾經(jīng)反復(fù)重建修復(fù)，可能會(huì)恢復(fù)骨的原有結(jié)構(gòu)及生理功能。骨折愈合的機(jī)制探索越來(lái)越吸引廣大研究者目光，骨折愈合相關(guān)的基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)也在逐漸形成共識(shí)，也一直是骨科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。筆者綜述了骨折愈合的相關(guān)影響因素和間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的機(jī)制研究進(jìn)展，力求為進(jìn)一步研究探索以啟發(fā)。

1 骨折愈合的影響因素

骨折愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的病理生理過(guò)程，涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞因子的共同作用，影響骨折愈合的因素也是多方面的。

1.1 影響骨折愈合的細(xì)胞因子 骨折區(qū)域內(nèi)血管的重塑、再生是啟動(dòng)骨折愈合的關(guān)鍵性因素之一，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前為止唯一發(fā)現(xiàn)的能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，有效促進(jìn)血管再生的細(xì)胞生長(zhǎng)因子［1］；并且與膜內(nèi)成骨、軟骨內(nèi)成骨等成骨反應(yīng)關(guān)系密切，在骨折愈合、骨不連及骨缺損的修復(fù)中起到正性調(diào)節(jié)的作用［2］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）存在于骨基質(zhì)中，是一種具有很強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)作用的酸性蛋白，能夠促進(jìn)骨折的愈合和修復(fù)［3-5］。β-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β），能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖以及膜內(nèi)成骨過(guò)程，在細(xì)胞和組織中的分布較為廣泛。Wildemann等將髓內(nèi)針涂上TGF-β涂層，用以治療大鼠脛骨骨折，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TGF-β可促進(jìn)骨折的愈合［6，7］。另外，在骨折愈合的急性反應(yīng)期，損傷之后，外周血細(xì)胞、骨髓內(nèi)血細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞在損傷部位共同形成血腫，骨折引起的急性反應(yīng)對(duì)于骨折的愈合是十分必要的。

在炎性期，腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1、IL-6、IL-11 及 IL-18 分泌增多，這些細(xì)胞因子能夠募集炎性細(xì)胞并促進(jìn)血管再生［8］。其中，TNF-α在損傷反應(yīng)的24 h內(nèi)濃度達(dá)到最高，72 h后又降回到基線。在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，巨噬細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞表達(dá)TNF-α，并認(rèn)為能誘發(fā)繼發(fā)性炎癥信號(hào)以及募集損傷修復(fù)所必需的細(xì)胞［9］。另外，體外實(shí)驗(yàn)顯示TNF-α能夠促進(jìn)MSCs的成骨分化［10］。而在所有的白介素中，對(duì)骨折影響最重要的是IL-1和IL-6。IL-1在炎癥急性期由巨噬細(xì)胞激活，在成骨階段誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6，并促進(jìn)原始軟骨骨痂的形成，并促進(jìn)骨折區(qū)新生血管的形成［11，12］。 另一方面，IL-6 只在急性期生成，能夠刺激血管生成，促進(jìn)產(chǎn)生VEGF，以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化［13］。

此外，近來(lái)有報(bào)道缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在骨修復(fù)中的重要作用，它能影響VEGF對(duì)血流的重建，并能調(diào)節(jié)MSCs的遷移［14］。

1.2 骨折局部力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折愈合的影響 骨折區(qū)的力學(xué)環(huán)境是影響骨折愈合一個(gè)極其重要的方面。早前德國(guó)外科醫(yī)師Julius Wolff最早提出力學(xué)環(huán)境對(duì)骨骼的改建和維持起重要作用。隨后的實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐證明力學(xué)環(huán)境在骨折愈合中的重要地位。研究表明，高剛度的固定器械可以限制骨斷端相對(duì)位移 （interfragmentary movement，IFM）從而抑制骨痂形成；一定范圍內(nèi)的IFM能夠促進(jìn)骨痂形成，但過(guò)量的IFM會(huì)抑制軟骨骨痂礦化，甚至造成骨不連的發(fā)生［15，16］。除了IFM的大小會(huì)影響骨痂形成外，IFM相對(duì)于骨折斷面的方向也是影響骨痂形成的重要因素。IFM相對(duì)于骨折斷面的方向主要有軸向擠壓、軸向牽拉、側(cè)向剪切和彎曲四種。研究證明，適度的軸向擠壓方向IFM能有效地促進(jìn)骨痂形成并加速軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程，從而使骨折能夠更快更好地愈合。同等大小的軸向牽拉方向的IFM則主要通過(guò)膜內(nèi)成骨的方式促進(jìn)骨折愈合［17］。側(cè)向剪切和彎曲的IFM抑制骨痂形成，降低骨折愈合組織的強(qiáng)度，延遲骨折愈合時(shí)間［18］。應(yīng)變?yōu)樵谕饬ψ饔孟拢瑔挝婚L(zhǎng)度的材料所發(fā)生的形變，即δ=△L/L，一般用百分比表示。不同組織在功能正常的狀態(tài)下可耐受的應(yīng)變范圍不同，完整骨骼所能承受的應(yīng)變約為2%（骨折發(fā)生前），肉芽組織所能承受的應(yīng)變則可達(dá)到100%。骨折愈合早期，骨折斷端以血腫和肉芽組織為主，可承受較大范圍的應(yīng)變。隨著軟骨骨痂的形成和礦化，骨斷端的剛性強(qiáng)度逐漸加大，骨痂的應(yīng)變逐漸減小，過(guò)大或過(guò)于頻繁的應(yīng)力會(huì)對(duì)骨折愈合造成極為不利的影響。

如上所述，二期愈合是最常見的骨折愈合方式，它并不需要完全穩(wěn)定的微環(huán)境，相反，微動(dòng)和應(yīng)力反而促進(jìn)其愈合。但是，如果微動(dòng)和應(yīng)力超過(guò)一定的幅度，則可能會(huì)導(dǎo)致骨折延遲愈合或者骨不連的發(fā)生［19］。

雖然骨折愈合期間，力學(xué)環(huán)境影響骨折修復(fù)的重要性已經(jīng)逐漸受到重視。但力學(xué)環(huán)境影響骨愈合過(guò)程的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制仍不甚清楚。適當(dāng)?shù)臋C(jī)械牽張力可促使成骨細(xì)胞內(nèi)一些基因的表達(dá)增加。如上所述，這些基因在新骨生成過(guò)程中都起著重要作用，如早期反應(yīng)基因 （c-fos、c-jun、cox-2）、BMP、 堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）及骨鈣素、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、膠原蛋白、TGF-β、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、VEGF、 胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factors，IGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子 （platelet-derived growth factor，PDG）等［20，21］。

1.3 影響骨折愈合的其他因素 生長(zhǎng)激素能刺激骨和軟骨的生長(zhǎng)和分化，增加骨密度。它能直接作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化，激活A(yù)LP，提高基質(zhì)中的Ca2+濃度。Fukuhara等發(fā)現(xiàn)無(wú)論是給予甲狀旁腺激素合成物的大鼠還是行甲狀旁腺切除術(shù)的大鼠，骨折愈合進(jìn)度都有所延遲［22］。切除甲狀旁腺的大鼠，軟骨內(nèi)骨化和主要的松質(zhì)骨的二次重塑都有所延遲，因而導(dǎo)致骨折愈合過(guò)程的受損。而給予甲狀旁腺激素合成物的大鼠，在早期階段對(duì)骨吸收和形成顯示促進(jìn)作用。在后期階段，骨形成良好但骨吸收較差，表明二次骨重塑降低了，愈傷組織有所受損。甲狀旁腺素可能是骨折愈合的重要因素之一。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞在骨折愈合中的作用

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類特殊的干細(xì)胞，來(lái)源于中胚層的成體干細(xì)胞，能夠自我增殖并具有多向分化潛能［23］，普遍存在于人體各組織器官中，以骨髓含量最豐富。而骨髓腔中的MSCs作為一種多能干細(xì)胞，是成骨細(xì)胞的體內(nèi)來(lái)源。間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力決定著成骨分化能力。大量研究結(jié)果顯示，MSCs不僅能分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等中胚層細(xì)胞［24，25］，而且可以向神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島素細(xì)胞等內(nèi)胚層或外胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)化［24-27］。

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的分化與調(diào)控 軟骨內(nèi)成骨是體內(nèi)主要的成骨方式，在MSCs分化為成熟軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的過(guò)程中，涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的有序表達(dá)，其中 Runx2、Sox9家族是發(fā)揮主導(dǎo)作用的調(diào)節(jié)因子之一。Runx2是MSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的主控轉(zhuǎn)錄因子，能激活與啟動(dòng)MSCs向成骨細(xì)胞系分化并能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成熟［28，29］；Osterix（OSX）位于成骨細(xì)胞分化路徑中Runx2的下游，調(diào)控成骨細(xì)胞的生成［30，31］。Sox9 是 MSCs 向軟骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的主控轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于軟骨細(xì)胞譜系的生成及軟骨特異性蛋白的表達(dá)是必不可少的［32］。Runx2、OSX、Sox9的表達(dá)水平可以作為MSCs分化方向的直接參考［33］。

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞與骨折愈合 MSCs的遷移對(duì)于骨折愈合來(lái)說(shuō)是必要的。骨斷端募集的的MSCs的來(lái)源至今仍未明確，可能來(lái)自于周圍組織和/或循環(huán)當(dāng)中，細(xì)胞可能的來(lái)源包括骨髓、骨膜、血管壁、肌肉、循環(huán)血和其他組織器官［34］。有研究顯示，當(dāng)骨骼受損時(shí)一系列特殊的分子在受損部位釋放出來(lái)并進(jìn)入循環(huán)，隨后受傷組織部位以及循環(huán)中的MSCs遷移至受損部位并向特定組織分化［35］。新近的研究［36］顯示，在骨折經(jīng)久不愈的患者中，采用異體皮質(zhì)人工骨復(fù)合物移植的方法進(jìn)行治療，該方法的特色即在于首先提取患者自體髂骨紅骨髓分離間充質(zhì)干細(xì)胞并與骨形態(tài)發(fā)生蛋白共同培養(yǎng)，進(jìn)一步以異體皮質(zhì)人工骨為支架材料，同時(shí)導(dǎo)入骨形態(tài)發(fā)生蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)人工合成方式制成人工骨復(fù)合物，經(jīng)手術(shù)植入骨缺損患處，在此治療過(guò)程中，骨支架接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)骨愈合能力，在異位移植中也有成骨的特性，還有研究表明異體骨有良好誘導(dǎo)骨產(chǎn)生的特性，異體骨在軟組織中的組織相容性好，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。但該過(guò)程具體涉及哪些分子的調(diào)節(jié)仍然存有爭(zhēng)議。

另外，MSCs屬于非造血系干細(xì)胞，表達(dá)CD105、CD73 及 CD44、CD29、CD90， 其中 CD44 是參與骨折愈合的重要因子之一。目前，普遍認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面 CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD34表達(dá)陰性，實(shí)驗(yàn)中即按照 CD44+/CD34-進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定，并移植入股骨骨折動(dòng)物模型。CD44是一種透明質(zhì)酸受體［37，38］；早有研究［39］發(fā)現(xiàn)，CD44-透明質(zhì)酸相互作用與細(xì)胞遷移能力相關(guān)，如T細(xì)胞趨向炎癥部位和間充質(zhì)干細(xì)胞遷移向損傷部位等。Zhu等［40］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與 CD44-/-的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，CD44+/+細(xì)胞表現(xiàn)出了更強(qiáng)的遷移能力。新近的文獻(xiàn)［41］報(bào)道，在骨折中 CD44-透明質(zhì)酸對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢作用影響明顯，發(fā)現(xiàn)CD44表達(dá)有助于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移從而對(duì)損傷的修復(fù)作用，可以推測(cè)CD44可能是細(xì)胞具有高遷移能力的機(jī)制之一。

一直以來(lái)，BMP-2被認(rèn)為對(duì)MSCs的募集有著重要的意義，但也有人認(rèn)為BMP-2只是對(duì)骨折的愈合作用很大，而其他的BMPs比如 BMP-7卻在祖細(xì)胞的募集過(guò)程中發(fā)揮重大作用?，F(xiàn)有報(bào)道稱，在體內(nèi)，MSCs的遷移主要是通過(guò)SDF-1/CXCL12軸調(diào)節(jié)。 SDF-1α 顯著刺激 VEGF，ANG-1，HGF，TGF-β的表達(dá)，并受其受體激動(dòng)劑AMD3100的抑制［42，43］。 近年來(lái)，SDF-1/CXCR4 在骨折愈合及 MSCs遷移過(guò)程中的作用逐漸被揭示。在骨骼損傷的急性期，SDF－1在骨膜表達(dá)，并使造血干細(xì)胞和表達(dá)CXCR4的間充質(zhì)干細(xì)胞在損傷部位聚集［28］。另外，Granero－Molto 等［44］研究發(fā)現(xiàn)移植的 MSCs 只有當(dāng)其表達(dá)CXCR4時(shí)才會(huì)聚集到骨折部位，而不表達(dá)CXCR4者卻沒有這個(gè)能力。由此推測(cè)微動(dòng)可能促進(jìn)SDF－1和CXCR4等與MSCs遷移相關(guān)的分子在損傷部位的表達(dá)和釋放，從而導(dǎo)致MSCs大量遷移至骨折區(qū)，從而促進(jìn)骨折的愈合。MSCs進(jìn)入骨缺損區(qū)域后，不但細(xì)胞自身可以釋放出促進(jìn)新骨生成的生物活性因子，還可以通過(guò)旁分泌機(jī)制間接促進(jìn)新血管的生成與成熟，這一過(guò)程對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)至關(guān)重要［45，46］。但目前對(duì)于力學(xué)環(huán)境影響骨折區(qū)MSCs募集的具體機(jī)制及其涉及的相關(guān)信號(hào)通路，尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，骨折愈合涉及多方面的因素，而隨著研究的不斷深入，對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)也越來(lái)越來(lái)越清晰，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨折愈合中的作用也逐漸被揭示。目前，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)開始用于臨床骨科疾病的治療中，例如在股骨頭壞死及骨折的延期愈合等疾病的治療中都取得了可喜的療效。與此同時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞的體外移植的治療方法卻由于技術(shù)操作所局限，存在先天的不足，未能廣泛的應(yīng)用于臨床。該綜述對(duì)骨折愈合的影響因素及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨折愈合作用進(jìn)行了總結(jié)，為骨折愈合的機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考。

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