吳 鵬，武 文

抗體藥物在生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用途最廣泛。1975年和Milstein建立了B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得針對(duì)單一抗原決定簇的高特異性抗體，這是抗體產(chǎn)生的重大技術(shù)革命，該技術(shù)使人類通過細(xì)胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體（monoclone antibody，McAb）［1］。 單克隆抗體在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的基礎(chǔ)研究及臨床疾病的診斷和治療起到了里程碑的作用。但是，抗體的導(dǎo)向療法尚存在著較大的困難：（1）抗體在機(jī)體免疫原性大：鼠源抗體，常會(huì)誘導(dǎo)人抗鼠抗體的免疫應(yīng)答；（2）難以獲得所需特異性的免疫球蛋白的特定亞類：完整的大分子抗體不一定能到達(dá)作用部位，抗體恒定區(qū)的其他功能會(huì)引起一些不良反應(yīng)；（3）人的雜交瘤制備較為困難，直接用人的單克隆抗體治療疾病尚難開展。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展，一種來源于自然界存在的，通過基因工程研究結(jié)合納米技術(shù)研發(fā)的納米抗體，因具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易于表達(dá)、在血液中半衰期相對(duì)較短、穿透力強(qiáng)、免疫原性弱等特點(diǎn)，在抗腫瘤、抗病毒等領(lǐng)域具有廣闊前景。

1 納米抗體簡介

納米抗體是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家在傳統(tǒng)抗體的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合納米粒子科學(xué)的概念，從而研發(fā)出的最新和最小的抗體分子［2］。1993年，Hamers-Cazterman 等［3］在單峰駝以及雙峰的亞洲駝和南美駱駝的血清中發(fā)現(xiàn)一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體（HCAb），克隆重鏈抗體的可變區(qū)得到只由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱為VHH抗體 （variable domain of heavy chain of heavychain antibody），其晶體結(jié)構(gòu)呈橢圓形，直徑2.5 nm，長4 nm，是最小的功能性抗原結(jié)合片段，又被稱為納米抗體（Nanobody）［4］。

1.1 納米抗體的結(jié)構(gòu)特征駱駝重鏈抗體可變區(qū)的納米抗體（VHH），其分子質(zhì)量為15KDa，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 Fab 段（60 KDa）和普通抗體（150 KDa）［5］。存在于羊駝體內(nèi)天然重鏈抗體的分子結(jié)構(gòu)為：鉸鏈區(qū)形成的鏈間二硫鍵連接兩條完全相同的重鏈，每條重鏈分子有一個(gè)獨(dú)特的重鏈可變區(qū)（VhH）、一個(gè)鉸鏈區(qū)和CH2、CH3兩個(gè)恒定區(qū)。在IgG的重鏈分子中，恒定區(qū)CH1是與輕鏈經(jīng)鏈間二硫鍵相連的部位，CH1在重鏈抗體的基因組中也存在，但在其mRNA形成過程中被剪切，形成沒有輕鏈和CH1區(qū)的駱駝重鏈抗體［6］。

駱駝重鏈抗體的VHH和人抗體重鏈的VH結(jié)構(gòu)非常相似［7］，大概有75%的同源性，包含了三個(gè)高變區(qū)（CDRs）和其兩側(cè)的四個(gè)骨架區(qū)（FRs），由于輕鏈缺失，納米抗體僅有3個(gè)CDRs區(qū)，雖然與普通抗體的6個(gè)CDRs區(qū)相比，納米抗體缺少3個(gè)CDRs區(qū)，但其具備了相當(dāng)特異的結(jié)合能力和親和力。因?yàn)榧{米抗體的CDR3含有16~18個(gè)氨基酸殘基，比人和鼠的VH分別有12和9個(gè)氨基酸殘基的CDR3長，這使得納米抗體識(shí)別罕見的、隱藏的抗原表位，結(jié)合蛋白質(zhì)、酶抗原的凹陷部位和活性位點(diǎn)成為可能［8］，并且納米抗體的CDR3區(qū)域可形成一個(gè)大的暴露的凸環(huán)，凸環(huán)中的一個(gè)半胱氨酸與CDR1或FR2的45位點(diǎn)的半胱氨酸形成二硫鍵［9］，可使其生物結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，從而大大降低納米抗體與抗原結(jié)合所需能量［10］，可獲得高親和力的納米抗體。另外，在一般抗體 VH 的 FR2中，V37，G44，L45和 W47這4個(gè)氨基酸殘基參與VL的相互作用，而在重鏈抗體的VHH基因序列中，這4個(gè)氨基酸殘基分別突變?yōu)?F（Y）37，E44，R45，G47，由疏水性變成了親水性，這樣大大增加了納米抗體的溶解性［11］。

1.2 納米抗體的獨(dú)特優(yōu)勢

1.2.1 結(jié)構(gòu)簡單，易于純化和表達(dá) 納米抗體在化學(xué)構(gòu)成及分子量等方面比普通抗體要簡單并且小得多，使用基因工程方法可使納米由單一的基因編碼，并能在原核及真核細(xì)胞中高效表達(dá)和純化。重組納米抗體通常在E coli中表達(dá)量為10 ms/L［12］。納米抗體結(jié)構(gòu)簡單，便于進(jìn)行基因、分子操作和改造，易進(jìn)行藥物研發(fā)和縮短藥物的研發(fā)周期。

1.2.2 親和力及穩(wěn)定性高 雖然納米抗體缺少輕鏈，但因抗體的CDR3區(qū)可以形成一個(gè)大的暴露的凸環(huán)，凸環(huán)中的二硫鍵使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，仍然保持了較高的穩(wěn)定性。將納米抗體在37℃放置1周或加熱至90℃高溫［13］，再將其放置室溫，仍具有折疊復(fù)性［14］、恢復(fù)抗原結(jié)合能力［15］。 此外，納米抗體的穩(wěn)定性高，其在通過小鼠的消化道時(shí)，仍能保持原有的生物活性，顯示納米抗體具有能抵抗胃腸道蛋白消化酶和耐低 pH 的特性［16，17］。 Zhang 等將從羊駝天然納米抗體噬菌體基因庫中篩選的單域納米抗體改造成為五聚化的抗體，極大地提高了抗體與抗原的親和力［18］。五聚體納米抗體與單價(jià)納米抗體相比，熱穩(wěn)定性以及抗蛋白酶降解的特性都有明顯改善。所以，納米抗體可用于酶的抑制劑［19］、受體的激動(dòng)劑或拮抗劑［20，21］等。

1.2.3 組織滲透力強(qiáng) 納米抗體，不僅能穿過血管進(jìn)入組織，且能通過血腦屏障，具有極強(qiáng)的穿透力。Pleiner等用靶向納米造影劑顯像豬血管成形術(shù)后的頸動(dòng)脈，發(fā)現(xiàn)受到過度牽拉的那段血管平滑肌回聲顯著增強(qiáng)，而對(duì)血管壁內(nèi)皮信號(hào)無明顯影響，該結(jié)果有力地證實(shí)了納米級(jí)造影劑具有穿越血管內(nèi)皮間隙使血管外靶組織顯像的能力［22］。

1.2.4 免疫原性低，易于人源化改造 由于納米抗體為單域小分子抗體，其因缺失Fc段而不會(huì)產(chǎn)生抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，大大降低了產(chǎn)生免疫反應(yīng)的可能性。另外，納米抗體VHH基因序列與人的VH3序列高度同源，僅有兩個(gè)地方存在主要不同：（1）VHH 的 CD3 略長于人的 VH；（2）VHH與人源VH僅有10個(gè)氨基酸存在明顯差別，由此可見，納米抗體非常易于改造，并且免疫原性遠(yuǎn)低于其他抗體。

1.2.5 無不良反應(yīng) 納米抗體藥物臨床試用階段無不良反應(yīng)報(bào)告。比利時(shí)Ablynx公司的抗急性血栓納米抗體、抗乳腺癌HER-2納米抗體等藥物已完成I期臨床試驗(yàn)，抗TNF-α、TNF受體的納米抗體藥物已進(jìn)入到市場前期階段。

2 納米抗體的臨床應(yīng)用

2.1 納米抗體在實(shí)驗(yàn)診斷中的應(yīng)用腫瘤的早期診斷和治療效果監(jiān)控一直是研究者關(guān)注的問題。在癌癥的早期診斷中，腫瘤標(biāo)志物起重要作用，他們的存在和量變可以提示腫瘤的發(fā)生組織、細(xì)胞分化，可以早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤。目前，科學(xué)家已經(jīng)成功地分離出針對(duì)許多種腫瘤標(biāo)志物的小分子抗體。MUC1蛋白主要存在于乳腺、胰腺、卵巢等上皮組織和器官中，是由muc1基因表達(dá)的一種高糖基化（糖化＞50%）、高分子量（Mr＞200×103）蛋白，在癌變上皮細(xì)胞表面高度異常表達(dá)。MUC1納米抗體可特異性地識(shí)別乳腺及卵巢腫瘤細(xì)胞［23］，將標(biāo)記I131的MUC1抗體注射入荷瘤小鼠體內(nèi)，可靶向結(jié)合乳腺及卵巢腫瘤細(xì)胞，充分證明了納米抗體的腫瘤抗原靶標(biāo)作用。

為了在體內(nèi)快速而準(zhǔn)確地檢測腫瘤所在位置，理想的顯影劑應(yīng)具備良好的組織滲透性，高抗原親和力，非特異性噪聲背景低，未結(jié)合靶抗原的抗體能迅速清除，將放射損傷程度降到最低［24］。Cortez－Retamozo等［25］以單域抗體作為靶向分子構(gòu)建的顯影劑穿透性好，親和力高，在數(shù)小時(shí)內(nèi)腫瘤組織的顯像效果明顯提高，在正常的組織中沒有發(fā)現(xiàn)顯影劑的存在。

2.2 納米抗體在免疫治療中的重要作用

2.2.1 納米抗體作為酶抑制劑的應(yīng)用 納米抗體可做為酶抑制劑，抑制白細(xì)胞的胞外酶的活性。Ryutaro等通過人鼻病毒3C（humanrhinovirus 3C，HRV3C）蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，將雙特異性雙鏈抗體hEx3－ScDb（以EGFR和CD3為靶點(diǎn)）融合到人Fc區(qū)域，合成IgG樣BsAb的抑制腫瘤的效果明顯優(yōu)于已批準(zhǔn)上市的西妥昔單抗。1996年 Desmyter［26］首次制備出抗溶菌酶納米抗體，這種特異性的抗體在后續(xù)的各種實(shí)驗(yàn)中都顯示了較高的親和力、穩(wěn)定性，有效抑制了溶菌酶淀粉樣纖維的形成［27］。用TEM－1及BcII β－內(nèi)酰胺酶免疫單峰駱駝，可獲得特異性識(shí)別此類β－內(nèi)酰胺酶的納米抗體，有效抑制β－內(nèi)酰胺酶，使抗生素中的β－內(nèi)酰胺環(huán)免遭水解而失去抗菌活性［28］。 加拿大生物國立研究院［29］將攜帶有Bax特異VHH單域抗體編碼序列的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，顯示出較強(qiáng)的抗氧化性并明顯降低由H2O2引起的細(xì)胞毒性，為退行性病變提供了新的治療靶點(diǎn)。

Ablynx已開發(fā)出三株抗老年性癡呆的納米抗體，其中兩株納米抗體能與造成患者大腦淀粉樣病變的淀粉酶的活性位點(diǎn)的邊緣結(jié)合，對(duì)該酶活性有輕微的抑制，而另一株納米抗體能與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)該酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，所有這三種納米抗體將很快進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。另外，抗IL－6受體的納米抗體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療中，取得了理想的效果，為風(fēng)濕免疫病的治療提供了新思路［30］。

阿昔單抗（abeiximab，ReoPro）［31］，以血小板糖蛋白Ⅱb/Ina為靶點(diǎn)，用以防止血小板聚集及血栓形成，作為冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管插術(shù)時(shí)預(yù)防心肌缺血的輔助用藥，取得了巨大的成功。

Airesdasilva 等［32］將針對(duì) HIV－1 的 Vif蛋白的scFv的VH區(qū)進(jìn)行了特征性改造，發(fā)現(xiàn)改造后的抗體在細(xì)胞內(nèi)能有效表達(dá)，并具有很好的溶解性，能夠與Vif蛋白結(jié)合，中和HIV－1病毒的感染。

2.2.2 納米抗體在感染性疾病治療方面的應(yīng)用小分子抗體與超抗原的連接成為一個(gè)熱點(diǎn)，如T細(xì)胞超抗原葡萄球菌腸毒素A（staphylococcal enterotoxin A，SEA）等。 目前有多個(gè) Fab－SEA融合蛋白正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。Serruys［33］制備出5個(gè)納米抗體，可特異性的識(shí)別乙肝病毒的S蛋白，阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞，并證明納米抗體可在體內(nèi)有效阻止乙肝病毒的分泌。口蹄疫是一種急性、高傳染性微小RNA病毒，而從美洲駱駝身上獲得的納米抗體可以有效地中和病毒，起到被動(dòng)免疫的作用［34］。另外，抗脂多糖納米抗體治療內(nèi)毒素血癥［35］和抗非洲錐蟲病［36］的納米抗體，在體內(nèi)、體外的試驗(yàn)中，也取得了較好的治療效果。

2.2.3 納米抗抗體在腫瘤靶向治療中的作用GW572016是一個(gè)表皮生長因子受體1（epithelial growth factor receptor，EGFR）和表皮生長因子受體2（Her－2）的雙重抑制劑，其能夠有效抑制EGFR和Her－2過表達(dá)細(xì)胞的磷酸化，具有抗增殖和放射敏感化的作用。GW572016納米抗體的臨床實(shí)驗(yàn)也正在進(jìn)行中。納米抗體能選擇性的與人血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，介導(dǎo)藥物、多肽等大分子物質(zhì)穿過血腦屏障向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，起到了一定的治療作用［37］。將納米抗體直接結(jié)合在癌胚抗原和一個(gè)細(xì)菌B內(nèi)酰胺酶之間，構(gòu)建雙功能融合蛋白，能完全治愈LS174T人腺癌異種移植物，而沒有任何不良反應(yīng)［38］。

總之，納米抗體及其相關(guān)技術(shù)平臺(tái)是抗體工程研究的最前沿技術(shù)之一，由于其技術(shù)的先進(jìn)性和獨(dú)特性，在抗腫瘤、抗病毒等領(lǐng)域的治療、診斷和醫(yī)療保健方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

［1］G，MILSTEIN C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity ［J］.Nature，1975，256（5571）：495－497.

［2］DAVIES J，RIECHMANN L.Antibody VH domains as small recognition units［J］.Biotechnology，1995，13（5）：475-479.

［3］HAMERS-CAZTERMAN C，ATARHOUCH T，MUYLDERMANS S，et al.Naturally occourring antibodies devoid of light chains［J］.Nature，1993，363（6428）：446-448.

［4］MUYLDERMANS S，BARAL TN，CORTEZRETA V，et al.Camelid immun oglobulins and nanobody technongy ［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2009，128（1-3）：178-183.

［5］MUYLDERMANS S，CAMBILLAU C，WYNS L.Recognition of antigens by single-domain antibody fragments：the superfluous luxury of paired domains［J］.Trends Biochem Sci，2001，26（4）：230-235.

［6］NGUYEN VK，HAMERS R，WYNS L，et al.Loss of splice consensus signal is responsible for the removal of the entire CH1 domain of the functional camel IGG2A heavy-chain antibodies［J］.Mol Immunol，1999，36（8）：515-524.

［7］SU C，NGUYEN VK，NEI M.Adaptive evolution of variable region genes encoding an unusual type of immunoglobulin in camelids［J］.Mol Biol Evol，2002，19（3）：205-215.

［8］TRANSUE TR，dE GENST E，et al.Camel single-domain antibody inhibits enzyme by mimicking carbohydrate substrate［J］.J Proteins，1998，32（4）：515-522.

［9］DE GENST E，SAERENS D，MUYLDERMANS S，et al.Antibody repertoire development in camelids［J］.Develop Comp Immunol，2006，30（1/2）：187-198.

［10］GHAHROUDI MA，DESMYTER A，WYNS L et al.Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies［J］.FEBS Lett，1997，414（3）：521-526.

［11］MUYLDEMANS S，ATARHOUCH T，SALDANHA J，et al.Sequence and structure of VH domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains［J］.Protein Eng，1994，7（9）：1129-1135.

［12］ZARSCHLER K，WITECY S.High-yield production of functional soluble single-domain antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli［J］.Microb Cell Fact，2013，12（1）：97-110.

［13］VAN DER LINDEN RH，F(xiàn)RENKEN LG，HAMSEN MM.Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies［J］.Biochim BiophyActa，1999，1431（1）：37-46.

［14］PERZ JM，RENISIO，JG，PROMPERS JJ.Thermal unfolding of a llama antibody fragment：A two-state reversible process［J］.Biochemistry，2001，40（1）：74-83.

［15］PARASCHIV G，VINCKE C，CZAPLEWSKA P，et al.Epitope structure and binding affinity of single chain llama anti-βamyloid antibodies revealed by proteolytic excision affinitymass spectrometry［J］.J Mol Recognit，2013，26（1）：1-9.

［16］ADAMS GP，SCHIER R，MARSHALL K，et al.Increased affinity leads to improved selective tumor delivery of single-chain Fv antibodies［J］.Cancer Res，1998，58（3）：485-490.

［17］DUMOULIN M，CONRATH K，VAN MEIRHAEGHE A，et al.Single-domain antibody fragments with high conformational stability［J］.Protein Science，2002，11（3）：500-515.

［18］ZHANG J，TANHA J，HIRAMA T.Pentamerization of singledomain antibodies from phage libraries：a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents［J］.J Mol Biol，2004，335（1）：49-56.

［19］LAUWEREYS M，GHAHROUDI MA，DESMYTER A，et al.Portent enzyme inhibitors derived from dromedary heavy-chain antibody［J］.EMBO，1998，17（13）：3512-3520.

［20］SAERENS D，KINNE J，BOSMANS E，et al.Single domain antibodies derived from dromedary lymphnode and peripheral blood lymphocytes sensing conformational variants of prostatespecific antigen［J］.J Biol Chem，2004，279（50）：51965-51972.

［21］DESMYTER A，SPINELLI S，PAYAN F，et al.Three camelid VHH domains in complex with porcine pancreatic a-amylase：inhibition and versatility of binding topology［J］.J Biol Chem，2002，277（26）：23645-23650.

［22］PLEINER T，BATES M，TRAKHANOV S，et al.Nanobodies：site-specific labeling for super-resolution imaging，rapid epitope-mapping and native protein complex isolation［J］.eLife，2015，25（4）：e11349.

［23］TAYLOR-PAPADIMITRIOU J，BURCHELL JM，PLUNKETT T.MUC1 and the immunobiology of cancer［J］.Mammary Gland Biol Neoplasia，2002，7（2）：209-221.

［24］SAERENS D，KINNE J，BOSMANS E，et al.Single-domain antibodies derived from dromedary lymph node and peripheral blood lymphocytes sensing confirmation variants of prostatespecific antigen［J］.J Biol Chem，2004，279（50）：51965-51972.

［25］CORTEZ-RETAMOZO V，LAUWEREYS M，HASSANZADEH GH G，et al.Efficient tumor targeting by single-domain antibody of camel［J］.Int J cancer，2002，98（3）：456-462.

［26］DESMYTER A，TRANSUE T R，GHAROUDI MA.Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme［J］.Nat struct Biol，1996，3（9）：803-811.

［27］DUMOULIN M，LAST AM，DESMYTER A，et al.A camelid antibody fragment inhibits the formation of amyloid fibrils by human lysozyme［J］.Nature，2003，424（14）：783-788.

［28］CONRATH KE，LAUWEREYS M，GALLENI M，et al. β-Lactamase Inhibitors Derived from Single-Domain antibody Fragments Elicited in the Camelidae［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45（10）：2807-2812.

［29］GUEORGUIEVA D，LI S，WALSH N，et al.Identification of single-domain，Bax-specific intrabodies that confer resistance to mammalian cell against oxidative-stress-induce apotosis［J］.FASEBJ，2006，20（14）：2636-2638.

［30］VAN ROY M，VERERKEN C，BEIRNAERT E，et al.The preclinical pharmacology of the high affinity anti-IL-6R Nanobody ALX-0061 supports its clinical development in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2015，17（1）：135-139.

［31］VRGARA JIMENE Z J，TRICOCI P.Safety and efficacy of abciximab as an adjunct to pereutaneous coronary intervention［J］.Vasc Health Risk Manag，2010，6（3）：39-45.

［32］AIRESDASILVAF，SANTA-MARTAM，F(xiàn)REITAS-VIEIRAA，et al.Camelized rabbit-derived VH single-domain intrabodies against Vif strongly neutralize HIV-1infectivity［J］.J Mol Biol，2004，340（3）：525-542.

［33］SERRUYS B，VAN HOUTTE F，VERBRUGGHE P，et al.Llamaderived single-domain intrabodies inhibit secretion of hepatitis B virions in mice［J］.Hepatology，2009，49（1）：39-49.

［34］HARMSEN MM，VAN SOLT CB，F(xiàn)IJTEN HP，et al.Passive immunization of guinea pigs with llama single-domain antibody fragments against foot-and-mouth disease［J］.Vet Microbiol，2007，120（3/4）：193-206.

［35］KHATTABI EM，ADAMS H，HEEZIUS E，et al.Plasma singlechain antibody that blocks lipopolysaccharide binding and signaling：Prospects for therapeutic applications［J］.Clin Vaccine Immunol，2006，13（10）：1079-1086.

［36］BARAL TN，MAGEZ S，STIJLEMANS B，et al.Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolvtic factor［J］.Med Sci，2006，22（11）：914-916.

［37］MURUGANANDAM A，TANHA J，NARANG S.Selection of phagedisplayed llama single-domain antibodies that transmigrate across human blood-brain barrier endothlieum［J］.FASEAB，2001，16（2）：240-242.

［38］CORTEZ-RETAMOZO V，BACKMANN N，SENTER PD，et al.Efficicent cancer therapy with a nanobody-based conjugate［J］.Cancer Res，2004，64（8）：2853-2858.