甄陽光
(四川省水產學校,四川 成都 610041)
抗菌肽(AMPs)是生物體內經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽,其N端含極性氨基酸,富含Pro,而C端通常酰胺化[1-2]。1980年瑞典科學家在研究北美天蠶的免疫機制時,發(fā)現(xiàn)滯育蛹注射陰溝通桿菌及大腸桿菌后,其血淋巴中產生了具有抑菌作用的多肽類物質,即天蠶素[3-5]。后來,相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得有抗菌活性的多肽[6]。迄今為止,在不同動物組織中已發(fā)現(xiàn)千余種有抗菌作用的蛋白質和多肽,且有70余種的結構已被測定[7]。此外,因越來越多的細菌對傳統(tǒng)抗生素產生耐藥性,使AMPs受到廣泛的關注。目前,對AMPs的來源、理化特性、作用機制、安全性等進行了深入研究,并建立了AMPs網上更新數據庫。本文就AMPs的理化特性、作用機制和應用等作以綜述。
AMPs一般由12~50個氨基酸組成,無(弱)免疫原性,水溶性較好,等電點為8.9~10.7,且其一級結構具有較強的保守性,因富含疏水和堿性氨基酸而具有較強的陽離子特征,因此多數AMPs在正常生理條件下帶正電荷[8-11]。AMPs的自身濃度、外界溫度、鹽離子濃度及pH對其抑菌活性有重要影響[12]。當在60~100℃時,AMPs抑菌效果依然明顯,在121℃時其抑菌效果才有下降趨勢。純化后的蠶蛹AMPs在100℃處理20 min后對大腸桿菌的抑菌圈直徑仍可達1.80 cm;pH在7.0~7.5時抑菌圈平均直徑為1.98 cm,室溫放置3 h后抑菌圈直徑可達2.05 cm;鹽離子濃度在0.2 mol·L-1時抑菌圈直徑為2.02 cm[13]。表明AMPs具有較強熱穩(wěn)定性,在較強離子強度和較低的pH下仍可保持較強的活性,并且部分AMPs還有抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解的作用。
目前,對于AMPs的確切作用機制尚未準確定論,但研究者提出了多種假說,如形成膜通道、細胞內殺菌、調控免疫發(fā)揮抑菌活性等。
生理狀態(tài)下帶正電荷的AMPs以物理的方式吸附于細菌胞膜,破壞胞膜的完整性,導致胞質外漏而殺滅細菌[14]。帶正電荷AMPs能與細菌胞膜上帶負電荷的LTA、TA、LPS及LPG以靜電作用而吸附于細胞膜上,然后AMPs的疏水端嵌入磷脂雙分子層中牽引其進入磷脂雙分子層或改變膜表面張力或引起磷脂單分子層彎曲或形成肽-脂聚合物,從而擾亂雙分子層中脂質和蛋白質等組分原有的排列秩序,再結合AMPs分子間的相互運動,最終形成跨膜通道,導致胞內物質外漏引起死亡[15]。目前,跨膜通道以“桶板”“地毯”“環(huán)形孔”“ 聚集體”“筏沉沒”和“分子電穿孔”等模型備受關注,能較好地解釋AMPs的膜通道機制[16]。
研究表明,部分AMPs還有胞內作用靶標,即AMPs穿透胞膜進入胞質內,擾亂其生理活性,從而殺滅細菌[17]。如源于蛙的buforinⅡ可直接穿過胞膜進入胞質中積聚與DNA和RNA作用,當濃度在100 μg·mL-1時,其能完全抑制大腸桿菌DNA和RNA的合成,而在150~200 μg·mL-1時,其顯著抑制蛋白質的合成,最終殺滅菌體[18]。同樣地,AMPs PR39、NK-18、HNP1/2也能進入大腸桿菌菌體內抑制其DNA、RNA及蛋白質的合成[19]。另外,死亡素和人唾液抗菌蛋白富組蛋白能特異性地作用于線粒體,抑制細菌的呼吸作用達到殺菌目的[20]。此外,部分AMPs還可調節(jié)菌體基因表達,從而干擾細菌繁殖,如攻擊素、麻蠅素-Ⅱ能抑制大腸桿菌膜蛋白Omp(C、F、A)和LamB基因的表達及細胞壁成分的合成,導致菌體生長受阻[20]。
部分AMPs雖不能直接殺死細菌,但其可通過增強機體免疫力而發(fā)揮其抑菌活性[21]。AMPs能降低LPS誘導的炎癥反應,抑制促炎性因子的合成,而在正常生理狀態(tài)下可誘導促炎性細胞因子的分泌,從而募集免疫細胞提高機體抗感染能力,達到抑菌的目的[22-23]。
陽離子AMPs的作用機制與細菌細胞膜的結構和性質密切關系,因此AMPs發(fā)揮抑菌功能而不傷害宿主正常細胞主要是因細胞膜結構的差異所致。真核細胞膜主要是由鞘磷脂、中性磷脂和膽固醇等不帶電荷的物質組成,因此帶正電荷的AMPs不能與之結合。同時,真核細胞膜中含有細菌細胞膜中缺少的膽固醇,因此磷脂雙分子層更加穩(wěn)固,不易形成膜通道。真核細胞膜上磷脂的不對稱分布、細胞骨架的存在和體內血清成分等均可削弱AMPs對真核細胞的毒性作用。此外,AMPs的氨基酸組成決定了其兩親性、電荷量以及疏水程度等性質,也決定了其抑菌機制和對微生物細胞的選擇性[24]。
近年來,抗菌肽因具有與抗生素不同的殺菌機制和抗菌譜廣等特點,成為新型飼料添加劑,被廣泛應用于畜牧業(yè),其可抑制或殺滅宿主體內病原菌,改善腸道菌群,提高免疫力,促進動物生長。
在畜禽飼糧中添加AMPs能抑制病源微生物增殖代謝,改善宿主腸道菌群,促進畜禽生長發(fā)育,提高畜禽產品質量。不同濃度的AMPs能顯著降低仔公雞或肉雞腸道中大腸桿菌的豐度,提高雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量,改善腸道菌群,降低料重比,促進肉雞生長[27-28]。陳蕓等在山羊飼糧中添加復合AMPs能顯著降低變形菌門和螺旋菌門的含量,提高與生長相關的部分降解纖維菌屬和普雷沃菌屬的含量[29]。姜文等發(fā)現(xiàn),AMPs能顯著提高斷奶仔豬的末重、平均日增和直腸乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度,降低料重比、腹瀉率和大腸桿菌豐度,表明AMPs能顯著改善斷奶仔豬腸道菌群結構,提高其生長性能[30]。
AMPs是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,被認為是機體免疫的第一道防線,其能誘導單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、未成熟DC和T-淋巴等細胞的趨化性,調控B和T分泌細胞因子的模式,并產生多種趨化因子[31]。研究表明,AMPs可作為魚類潛在的防御性武器,用于防治新出現(xiàn)的破壞性疾病,其能快速擴散到感染部位,招募免疫細胞到感染組織中和病原體[32]。白建等用不同濃度的AMPs飼喂1日齡的AA肉雞,發(fā)現(xiàn)不同濃度的抗菌肽顯著提高21日齡肉雞的脾臟指數和胸腺指數和42日齡肉雞的法氏囊指數,認為AMPs能提高肉雞免疫器官指數[28]。劉莉如等用天蠶素AMPs飼喂海蘭褐蛋用仔公雞42 d,結果表明,血清中IgG、IgA,補體C3、溶菌酶含量顯著提高,認為AMPs可提高蛋用仔公雞的免疫力[27]。楊顏銥等發(fā)現(xiàn)復合AMPs能顯著提高川中黑山羊血清中IgA、IgG、IgM,IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ以及補體C3、C4的濃度,表明復合AMPs能增強山羊的免疫力[33]。也有研究表明,AMPs能結合LPS從而展現(xiàn)出抗炎活性,并在衰老過程中,AMPs與血清中IL-10、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α等細胞因子濃度呈現(xiàn)逆相關性,表明AMPs可以作為免疫調節(jié)劑[31,34]。
在原核生物、大多數真核生物及所有動物體內均存在具有防御作用的AMPs。因此,AMPs作為畜禽養(yǎng)殖等領域的飼料添加劑、治療劑或免疫調節(jié)劑等有巨大的潛力。大量研究已表明這些小生物活性肽的益生活性,但其具體機制尚不十分明確,并有研究報道部分細菌通過減弱AMPs結合、降低AMPs有效濃度、修飾細胞膜、形成生物膜及信號調節(jié)等方式產生對AMPs的耐受性。此外,AMPs在人類臨床上的應用仍然有限。因此,AMPs作為新一代抗微生物藥物具有廣闊的前景,但對于其作用機制、耐藥性、安全性和穩(wěn)定性等方面仍需要進一步的研究,只有綜合考慮AMPs的作用機制和細菌對其的抗性機制,避免在生產中濫用,才能揚長避短,造福人類。